侯曉奎 李元應(yīng)

（黃河交通學(xué)院，河南 武陟 454950）

馬尾松是我國(guó)重要的用材和綠化樹(shù)種之一，其遺傳多樣性是良種選繁的基因基礎(chǔ)。因此，對(duì)馬尾松種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 目的和意義

擬采用RAPD 標(biāo)記技術(shù)，分析和研究了35 份不同地域和緯度的馬尾松種源遺傳變異情況和數(shù)據(jù)，為馬尾松核心種質(zhì)資源庫(kù)的建立奠定良好的物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)馬尾松種質(zhì)資源的保護(hù)與可持續(xù)開(kāi)發(fā)利用，具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

2 材料與方法

2.1 材料

供試驗(yàn)的35 份馬尾松種質(zhì)資源材料，全部來(lái)自三明市大田縣桃源國(guó)有林場(chǎng)試驗(yàn)基地。2018 年3 月，從林場(chǎng)種質(zhì)資源試驗(yàn)基地中，每個(gè)種源抽選5 株，采集剛抽生的嫩梢，冷藏于-20℃冰箱中保存，供提取其DNA 使用。

2.2 儀器與試劑

RAPD 引物選用生工生物工程（上海）有限公司的S 系列引物，TaqDNA 聚合酶、dNTPs（dNTP Mix）購(gòu)自深圳市基因谷科技有限公司；PCR 擴(kuò)增儀為M J Reareh PTC-200，電泳儀為北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-Ⅱ型，凝膠成像系統(tǒng)為Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)。

2.3 方法

2.3.1 DNA 提取與檢測(cè)。采用CTAB 法提取DNA，從提取的DNA 樣品中取出10μL，稀釋到1000μL，然后在UV-7504型紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA 的純度、濃度和產(chǎn)率，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 質(zhì)量。

2.3.2 RAPD-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)與優(yōu)化。RAPD-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系25μL，內(nèi)含50ng 模板DNA，2.0mmol/LMgCl2，0.8μmol/L引物，0.25mmol/LdNTPs，1UTaqDNA 聚合酶，1×buffer 緩沖液。再選擇一個(gè)基本擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，36.5℃退火1min，72℃延伸2 min，45 個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min，退出。

隨機(jī)抽取同樣株的DNA 為模板，以TaqDNA 聚合酶、引物濃度、DNA 模板濃度、Mg2+濃度、dNTP 濃度為優(yōu)化因子，分別設(shè)置不同的梯度，S91（5'-TGCCCGTCGT-3'）作為本優(yōu)化試驗(yàn)的引物。優(yōu)化時(shí)保持基本擴(kuò)增體系不變，在基本擴(kuò)增程序上，每次只改變1 個(gè)擴(kuò)增參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠于3V/cm 電場(chǎng)中電泳，染色，觀察、記錄、分析并拍照。

2.3.3 RAPD-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)引物篩選。選擇差異性較大的3份DNA 樣品，以前面篩選出的RAPD 擴(kuò)增程序和擴(kuò)增體系，用所選購(gòu)的200 條隨機(jī)引物進(jìn)行RAPD 擴(kuò)增試驗(yàn)，從中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性高的引物用于馬尾松種質(zhì)資源的RAPD 分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 RAPD-PCR 最佳反應(yīng)體系與反應(yīng)程序確立

通過(guò)篩選TaqDNA 聚合酶用量、引物濃度、模板DNA 濃度、Mg2+濃度、dNTPs 濃度等因子，RAPD-PCR 較為理想的擴(kuò)增體系為：在擴(kuò)增反應(yīng)總體積25μL 中，包含25ng 模板DNA，2.5mmol/LMgCl2，0.8μmol/L 引 物，0.16mmol/L dNTP，1.0UTaqDNA 聚合酶，1×Buffer 緩沖液。通過(guò)優(yōu)化熱循環(huán)參數(shù)，較為理想的擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性1 min，37℃退火1 min，72℃延伸2 min，45 個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min 退出。

3.2 擴(kuò)增結(jié)果統(tǒng)計(jì)及譜帶分析

用前面優(yōu)化出的RAPD 反應(yīng)條件，從需要分析的樣品中抽取3 份DNA 樣品作為模板，對(duì)S 系列的200 條隨機(jī)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增試驗(yàn)。從該200 條隨機(jī)引物中篩選出了18 個(gè)可用于馬尾松RAPD 分析的隨機(jī)引物。引物號(hào)及序列見(jiàn)表1。

經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)，用篩選出來(lái)的18 個(gè)RAPD 引物對(duì)35 份馬尾松樣品進(jìn)行擴(kuò)增試驗(yàn)，共檢測(cè)到153 個(gè)條帶，其中多態(tài)位點(diǎn)為137 個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)百分率為89.5%。每個(gè)引物檢測(cè)到的條帶數(shù)介于4～17 條，平均每個(gè)引物為8.5 條，不同引物的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度在300～3800bp。其中擴(kuò)增位點(diǎn)最多的是S66，S91和S150，分別擴(kuò)增出的位點(diǎn)數(shù)為17，15 和15。擴(kuò)增位點(diǎn)最少的是S65 和S141，僅擴(kuò)增出4 條清晰的條帶。這證明了RAPD 可以準(zhǔn)確檢測(cè)出馬尾松種質(zhì)資源的遺傳多樣性。引物S66 的RAPD 擴(kuò)增譜帶（如圖1）。

圖1 RAPD 標(biāo)記中S66 號(hào)引物擴(kuò)增出來(lái)的DNA 譜帶

表1 RAPD 分析所用引物及其擴(kuò)增譜帶數(shù)

3.3 遺傳多樣性分析

在對(duì)不同引物的擴(kuò)增產(chǎn)物試驗(yàn)過(guò)程中，僅有個(gè)別品種或單株在其某一片段長(zhǎng)度處（位點(diǎn)）有條帶出現(xiàn)，這種其他品種或單株所不具備的條帶，可作為該品種或單株的特殊RAPD標(biāo)記。本試驗(yàn)共獲得8 條引物的共13 條RAPD 特異帶（見(jiàn)表2），這些標(biāo)記是某一品種或單株的特有條帶，是進(jìn)行特殊性狀標(biāo)記的基礎(chǔ)。通過(guò)比較條帶存在與否、條帶的多少及帶型的差異可發(fā)現(xiàn)不同品種或單株之間的差異、遺傳多樣性和親緣關(guān)系。

利用SPSS11.5 的聚類(lèi)分析功能分析35 份樣品的RAPD擴(kuò)增所得到的譜帶數(shù)矩陣，計(jì)算各樣品間的遺傳相似系數(shù)（GS），從遺傳相似系數(shù)來(lái)看，馬尾松種質(zhì)資源遺傳多樣性較為豐富。35 份供試樣品兩兩之間的GS 值在0～1，平均為0.494。其中福建三明和福建閩清之間的遺傳相似系數(shù)最大，為1，說(shuō)明兩者之間的遺傳基礎(chǔ)相似，親緣關(guān)系非常接近。安徽屯溪與安徽潛山、廣西忻城與福建武平、湖南江永與江西靖江、湖北紅安與湖南常寧兩兩之間的相似系數(shù)分別為0.981、0.960、0.929、0.921，均高于0.92，說(shuō)明二者在基因組組成和核苷酸序列上極為相似。而四川南江與江西靖江遺傳相似系數(shù)最小，為0，即遺傳距離為1，表明它們之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。同時(shí)福建邵武與其它34 份樣品的遺傳相似系數(shù)均在低于0.352，且僅與3 個(gè)樣品大于0.3，說(shuō)明與其它樣品間的差異最明顯。

表2 RAPD 擴(kuò)增的特異引物和特異標(biāo)記

4 結(jié)論與討論

從篩選出來(lái)的18 個(gè)RAPD 引物對(duì)35 份馬尾松種質(zhì)資源進(jìn)行了DNA 擴(kuò)增試驗(yàn)，共檢測(cè)到153 條RAPD 標(biāo)記條帶，其中多態(tài)性帶137 條，多態(tài)性百分率為89.5%，不同引物的擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度在300～3800bp，平均每個(gè)引物檢測(cè)到的條帶數(shù)為8.5 條。不同引物的擴(kuò)增片斷的數(shù)目及其多態(tài)性程度均不同，但都呈現(xiàn)出了豐富的多態(tài)性，證明了RAPD 可以準(zhǔn)確檢測(cè)馬尾松種質(zhì)資源的遺傳多樣性。采用聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)遺傳關(guān)系，僅由種質(zhì)材料來(lái)源區(qū)域的遠(yuǎn)近和生產(chǎn)上品種的名稱(chēng)判斷很難得到準(zhǔn)確信息。

因此，只有借助于各種新的分子層級(jí)水平的檢測(cè)手段才能取得更加有效、更加準(zhǔn)確的分析和評(píng)估，為資源保護(hù)利用和育種選繁實(shí)踐提供有力的支撐。鑒于RAPD 標(biāo)記存在一定的局限性，下一步應(yīng)逐步嘗試使用其他的分子標(biāo)記技術(shù)手段，如ISSR、AFLP 進(jìn)行更深層次的分析。