魯振強(qiáng)，王錦霞，，董大鵬 ，，張司揚(yáng)，劉大麗

（1.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150080；2.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗室/黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱150080；3.哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，哈爾濱150025）

0 引言

金屬伴侶蛋白（Metallochaperones）是一類細(xì)胞質(zhì)可溶蛋白，它通過參與結(jié)合重金屬離子，以阻止金屬與其它細(xì)胞組分發(fā)生毒害反應(yīng)，同時，幫助細(xì)胞安全地運(yùn)輸金屬離子[1-2]。在植物細(xì)胞中，Metallochaperones是參與重金屬逆境脅迫和離子安全轉(zhuǎn)運(yùn)最為關(guān)鍵的蛋白家族之一。迄今為止，在藻類、真菌以及動物細(xì)胞中，僅發(fā)現(xiàn)了數(shù)量有限的金屬伴侶蛋白；與之相反的是，在植物體內(nèi)，Metallochaperones卻擁有龐大的家族，總體上來說，這類蛋白被分為兩大類：第一類是重金屬關(guān)聯(lián)植物蛋白（Heavy metal-associated plant proteins，HPPs）；第二類是重金屬關(guān)聯(lián)異戊二烯化植物蛋白（Heavy metal-associated isoprenylated plant proteins，HIPPs）[3-4]。其中 ，HIPPs的 獨(dú)特 特性是 由其 重金屬 結(jié)合域（heavy metal associated domains，HMA，pfam00403.6）以及異戊二烯化序列（isoprenylation motif）決定的。大多數(shù)HIPPs的HMA和isoprenylation motif之間還存在著一個靈活的富含甘氨酸的區(qū)域[3,5]。HMA具有一個核心氨基酸序列結(jié)構(gòu)M/L/IxCxxC，并且擁有兩個保守的半胱氨酸殘基以參與重金屬離子的結(jié)合[6]。在動物、酵母、細(xì)菌和某些植物體內(nèi)，一些HMA的結(jié)合基團(tuán)特異的螯合Cu，并參與Cu的離子平衡[7]。除了Cu以外，HMA結(jié)構(gòu)域被發(fā)現(xiàn)還擁有鎳或者鋅等的結(jié)合活性[6,8]。不同物種體內(nèi)的HMA-containing proteins在包括重金屬Cd在內(nèi)的運(yùn)輸以及離子代謝平衡方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

異戊二烯化（Isoprenylation）是在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生的一種翻譯后蛋白修飾作用。這種修飾作用過程是在蛋白質(zhì)C端具有CaaX框架蛋白質(zhì)的半胱氨酸基團(tuán)的巰基上增加15個carbon farnesyl或者20個carbongeranylgeraniol[4,9]。而翻譯后修飾可以徹底地改變蛋白質(zhì)的功能和特性，進(jìn)而在植物逆境生理中發(fā)揮作用[1]。盡管HMA domain以及異戊二磷酸化過程各自在很多生物體中比較常見，但兩種結(jié)構(gòu)同時存在于一種蛋白中卻僅在植物中被發(fā)現(xiàn)[6]。這種特殊的結(jié)構(gòu)可以使植物HIPPs基因家族通過重金屬離子平衡調(diào)控在解毒機(jī)制中發(fā)揮作用（特別是在Cd的耐受性方面）[4-5,8,10]。1999年，研究人員首次發(fā)現(xiàn)HIPPs蛋白具有結(jié)合Cu2+、Ni2+、Zn2+的能力[6]，隨后的研究發(fā)現(xiàn)，HIPPs還可以結(jié)合Cd、Hg、Pb等重金屬離子，但對Co、Mn、Ca沒有特異結(jié)合能力[5,8]。而在植物中，迄今為止僅有很少一部分HIPPs基因得到研究，并且研究主要集中在擬南芥這種模式植物中。

在研究小組前期對能源甜菜在Cd逆境脅迫下轉(zhuǎn)錄組學(xué)等的研究中發(fā)現(xiàn)[11]，甜菜BvHIPP24的上調(diào)表達(dá)差異對于不同濃度Cd的逆境響應(yīng)極為顯著，推測該基因很有可能在鎘的解毒代謝以及區(qū)隔化中扮演著重要的角色。因此，本研究以BvHIPP24——甜菜重金屬關(guān)聯(lián)的異戊二烯蛋白基因為研究對象，通過基因克隆以及大腸桿菌原核表達(dá)，體外分析該基因在重金屬鎘逆境脅迫下的作用機(jī)制和功能，為研究和開發(fā)能源甜菜獨(dú)特的耐重金屬基因資源提供候選基因，也為利用能源甜菜進(jìn)行重金屬污染生物修復(fù)以及生物質(zhì)能研發(fā)奠定良好的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料

甜菜種子780016B/12優(yōu)，由國家甜菜種質(zhì)資源中期庫（國家甜菜種質(zhì)資源平臺）提供。稱取1 g甜菜幼苗植物組織，用于總RNA的提取以及基因克隆。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1RNA的提取

本研究利用Trizol法提取甜菜的總RNA。分別利用紫外分光光度計NavoVue plus在OD260和OD280下以及1.0%瓊脂糖凝膠，檢測RNA濃度和純度。

1.2.2RT-PCR

根據(jù)甜菜Beta vulgaris heavy metal-associated isoprenylated plant protein24（BvHIPP24，LOC104905684）基因的堿基序列設(shè)計引物：[Forward primer(5′-3′):ATG GGA GTA CAA GGA ACT TTG GAA；Reverse primer(5′-3′):CCG CTC GAG(XhoI)CTA CAT AATATAACAAGC ACC]。以First strand cDNA synthesis kit（TOYOBO）反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用KOD-Plus-Neo高保真酶（TOYOBO）PCR擴(kuò)增目的基因全長。

1.2.3 大腸桿菌原核表達(dá)重組載體的構(gòu)建

取4μL PCR產(chǎn)物，于25℃連接到pEASY-Blunt E1載體（TransGen）上，并轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中。提取Amp抗性陽性克隆質(zhì)粒DNA，并利用XbaI和XhoI對重組質(zhì)粒進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切鑒定。所獲得的陽性克隆進(jìn)一步于上海生工測序，確定其堿基序列的完整性。

1.2.4 融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

將重組質(zhì)粒（pEASY-Blunt E1-BvHIPP24）以及對照質(zhì)粒（pEASY-Blunt E1）分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中。挑取重組菌株以及對照菌株單克隆，培養(yǎng)于2xYT+Amp培養(yǎng)基中。加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，誘導(dǎo)His-tag融合蛋白的表達(dá)。分別于0、30、60、90、120、180和240 min收集菌液，提取菌液粗蛋白；利用SDSPAGE進(jìn)行蛋白質(zhì)變性凝膠電泳檢測。

1.2.5 鎘逆境下大腸桿菌生長曲線的測定

分別在OD600=0.1的重組菌以及對照菌液中加入終濃度為1 mmol/L的IPTG以及0.5 mmol/L的CdCl2，以未施加鎘逆境處理的菌株為條件處理對照，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔2個小時測定OD600值，重復(fù)3次實(shí)驗，繪制生長曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜BvHIPP24基因RT-PCR擴(kuò)增

根據(jù)Beta vulgaris heavy metal-associated isoprenylated plant protein24（BvHIPP24，LOC104905684）基因的堿基序列，以及大腸桿菌原核表達(dá)載體pEASY-Blunt E1的His-tag融合蛋白讀碼框順序設(shè)計特異引物，以較高純度和質(zhì)量的甜菜總RNA（圖1-A）反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用高保真Taq酶PCR擴(kuò)增目的基因。經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳的檢測，RT-PCR擴(kuò)增后，在445 bp左右的位置獲得了目的條帶（圖1-B）。此PCR產(chǎn)物與BvHIPP24基因預(yù)測的CDS區(qū)域的序列大小一致。

圖1甜菜BvHIPP24基因的RT-PCR擴(kuò)增Fig.1 RT-PCR amplification of BvHIPP24 gene

圖2 pEASY-Blunt-BvHIPP24重組質(zhì)粒的XbaI和XhoI限制性內(nèi)切酶酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid of pEASYBlunt-BvHIPP24 by restricted enzyme XbaI and XhoI M(Marker):Trans2K Plus II DNA marker(TransGen)

2.2 pEASY-Blunt E1-BvHIPP24重組載體的構(gòu)建

將PCR擴(kuò)增獲得的BvHIPP24基因片段連接到大腸桿菌表達(dá)載體pEASY-Blunt E1上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，并對陽性克隆的重組質(zhì)粒進(jìn)行XbaI和XhoI限制性內(nèi)切酶酶切鑒定。研究發(fā)現(xiàn)，在Agarose凝膠的5 716 bp和445 bp左右的位置上，獲得了相對應(yīng)于載體pEASY-Blunt E1和目的基因片段BvHIPP24的條帶（圖2）。將重組質(zhì)粒pEASY-Blunt E1-BvHIPP24測序，發(fā)現(xiàn)該基因被正確地擴(kuò)增并插入到pEASY-Blunt E1載體內(nèi)部。

圖3 SDS-PAGE下，大腸桿菌體內(nèi)His-tag-BvHIPP24融合蛋白的表達(dá)Fig.3 Expression of His-tag-BvHIPP24 fusion protein in E.coli by SDS-PAGE

2.3 甜菜BvHIPP24基因在大腸桿菌體內(nèi)的表達(dá)分析

將重組質(zhì)粒pEASY-Blunt E1-BvHIPP24轉(zhuǎn)化到BL21中，利用1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)甜菜BvHIPP24融合蛋白。如圖3所示，在SDS-PAGE中，未受到誘導(dǎo)的菌液粗蛋白中未發(fā)現(xiàn)目的基因所編碼蛋白的表達(dá)（lane1）；而隨著誘導(dǎo)的開始和時間的增加，在lane2～7中，18 kDa左右的位置出現(xiàn)了與His-tag融合蛋白大小相一致的片段。這說明，通過IPTG誘導(dǎo)物的誘導(dǎo)，甜菜BvHIPP24基因在大腸桿菌體內(nèi)被正確地表達(dá)和翻譯。

圖4鎘逆境脅迫下，BvHIPP24基因表達(dá)的大腸桿菌的生長曲線分析Fig.4 Growth curve of E.coli expressing BvHIPP24 gene under Cd stress

2.4 鎘逆境脅迫下BvHIPP24基因在大腸桿菌體內(nèi)的功能分析

以轉(zhuǎn)化pEASY-Blunt E1空載體的菌株為對照，對表達(dá)BvHIPP24的重組菌在鎘逆境下的生長狀態(tài)進(jìn)行了比較分析。結(jié)果（圖4-A）表明，在正常生長條件下，重組菌和對照菌的生長曲線的趨勢幾乎一致。與之相反的是，加入0.5 mmol/L CdCl2后，對照菌的生長受到了嚴(yán)重的抑制，幾乎無法正常生長；而表達(dá)BvHIPP24的重組菌卻表現(xiàn)出了優(yōu)于對照菌株的生長狀態(tài)，可以在一定程度上耐受Cd逆境的脅迫（圖4-B）。因此可以推斷，甜菜BvHIPP24基因在大腸桿菌抵御重金屬鎘的毒害中發(fā)揮著重要作用。

3 討論

重金屬鎘毒害通過抑制細(xì)胞功能物質(zhì)合成，破壞蛋白酶功能等，阻礙植物生長，甚至導(dǎo)致植物細(xì)胞死亡[12]。在植物的重金屬逆境調(diào)控機(jī)制中，對于重金屬離子的結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)甚至是區(qū)隔，是細(xì)胞解毒機(jī)制的重要一環(huán)。金屬伴侶蛋白在植物細(xì)胞運(yùn)輸重金屬離子方面發(fā)揮著重要作用。它們通過與金屬離子的緊密結(jié)合以及蛋白質(zhì)互作，來促進(jìn)離子交換以及特異轉(zhuǎn)運(yùn)，從而防止重金屬對細(xì)胞的破壞[1]。重金屬關(guān)聯(lián)異戊二烯化植物蛋白由于其獨(dú)特的金屬結(jié)合域和羧基末端的CaaX異戊二烯化蛋白基序的存在，成為金屬伴侶蛋白家族中最為重要的成員之一[3,6]。

通過前期對甜菜在重金屬Cd逆境脅迫下的轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，甜菜BvHIPP24基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)受到了Cd逆境脅迫的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，這也暗示了該基因參與到甜菜抗重金屬逆境脅迫機(jī)制過程中。為了驗證和分析BvHIPP24的應(yīng)答特性，本研究通過RT-PCR克隆了BvHIPP24，并通過外源基因重組的方式，將其誘導(dǎo)表達(dá)于大腸桿菌中，通過對重組菌的鎘逆境處理，發(fā)現(xiàn)該目的基因的大量表達(dá)可以在一定程度上提高大腸桿菌對Cd的耐受性。因此研究結(jié)果進(jìn)一步佐證了BvHIPP24在甜菜的重金屬耐受分子機(jī)制中的關(guān)鍵作用。同樣通過體外表達(dá)的方式，在Gao等的研究中發(fā)現(xiàn)，HIPP26可以絡(luò)合Cd2+、Cu2+、Pb2+，并且過量表達(dá)的AtHIPP26大大地提高了擬南芥對Cd的耐受性[5]。而在酵母體內(nèi)，通過表達(dá)AtHIPP20、AtHIPP22、AtHIPP26以及AtHIPP27蛋白，使得酵母在Cd敏感型和Cd耐受型之間發(fā)生了轉(zhuǎn)變[4]。而這種抗性的變化可能主要是由于細(xì)胞質(zhì)結(jié)合的Cd離子要遠(yuǎn)多于Cd在液泡中的區(qū)隔以及細(xì)胞外的運(yùn)輸。這些研究結(jié)果也進(jìn)一步說明了HIPPs家族成員具備了在植物體內(nèi)結(jié)合Cd的能力，并在植物的整個Cd離子解毒網(wǎng)絡(luò)機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。而在甜菜體內(nèi)，BvHIPP24基因獨(dú)特的Cd2+分子機(jī)理還有待于進(jìn)一步的研究。