張婷，楊永恒，孫玉明，侯孟蘭，李丕睿，原海燕，黃蘇珍，徐曉洋

（江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所/南京中山植物園，南京210014）

0 引言

甜菊（Stevia rebaudiana Bertoni）為菊科（Asteraceae）多年生草本植物，原產(chǎn)于巴拉圭、巴西等地，因其葉中富含甜味成分，在原產(chǎn)地已有數(shù)百年的食用歷史。研究證實(shí)甜菊葉中甜菊糖苷的甜度約為蔗糖的300～400倍，并具有低熱量，預(yù)防和輔助治療肥胖癥、糖尿病、高血壓和高血糖等優(yōu)點(diǎn)[1-2]，因此已被廣泛應(yīng)用于食品、飲料及醫(yī)藥等領(lǐng)域，甜菊亦成為繼甘蔗和甜菜之后最具開(kāi)發(fā)前景的天然糖料作物。

甜菊自19世紀(jì)70年代被從原產(chǎn)地引種后，目前全球主要栽培國(guó)家有中國(guó)、肯尼亞、巴拉圭、巴西和阿根廷等，其中中國(guó)的甜菊栽培面積約占全球的80%以上，主要的栽培省份包含江蘇、安徽和山東等地[3-4]，近年來(lái)隨著日照長(zhǎng)度較長(zhǎng)、病蟲(chóng)害發(fā)生較輕等區(qū)域優(yōu)勢(shì)，甘肅、新疆和內(nèi)蒙等省份逐漸成為甜菊的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)。然而由于甜菊喜好溫暖濕潤(rùn)環(huán)境，最適生長(zhǎng)溫度在25℃左右，而上述省份常會(huì)遭受低溫冷害甚至凍害，因此為了適應(yīng)西北和北方地區(qū)寒冷的氣候條件，防止甜菊葉產(chǎn)量和品質(zhì)的下降，提高甜菊植株的耐寒能力也已成為甜菊育種的重要目標(biāo)之一。除了通過(guò)傳統(tǒng)雜交育種手段對(duì)甜菊目標(biāo)性狀進(jìn)行改良之外，分子生物學(xué)手段也逐漸被應(yīng)用于甜菊育種工作中。Kim等已通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段獲得RA苷合成關(guān)鍵糖基轉(zhuǎn)移酶基因SrUGT76G1超表達(dá)的甜菊植株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株中RA苷和STV苷的比例明顯提高而總苷含量沒(méi)有明顯變化[5]，因?yàn)镽A苷相比于STV苷而言具有甜度更高、口感更優(yōu)良等特點(diǎn)[6]，因此表明轉(zhuǎn)化SrUGT76G1基因可以提高甜菊植株的糖苷品質(zhì)。Zheng等發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)糖苷合成路徑較上游SrDXS1和SrKAH基因均可提高總糖苷含量[7]。之前的研究主要關(guān)注糖苷合成路徑基因的挖掘，關(guān)于甜菊抗性分子生物學(xué)方面的研究較少。

AP2/ERF類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子家族是植物特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子家族，它們的家族成員均含有由60個(gè)左右氨基酸組成的保守結(jié)構(gòu)域，即AP2結(jié)構(gòu)域。根據(jù)結(jié)構(gòu)域的數(shù)量及序列的相似性，可將該家族進(jìn)一步分為AP2、ERF、RAV、CBF/DREB和特異蛋白AL079349即Soloist五個(gè)亞家族[8]，其中DREB亞家族基因被廣泛證實(shí)參與植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)，這個(gè)家族基因可以結(jié)合在啟動(dòng)子含有DRE/CRT（A/GCCGAC）元件的啟動(dòng)子上從而調(diào)控其表達(dá)[9-10]。DREB亞家族又可進(jìn)一步被分為A-1～A-6 6個(gè)亞組，其中A-1亞組基因與植物的耐寒性密切相關(guān)[11]。模式植物擬南芥包含6個(gè)該亞組成員，其中DREB1A、DREB1B和DREB1C基因均可迅速受冷脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，另外其過(guò)表達(dá)亦均可提高擬南芥的耐寒性[12-14]。因此，本研究根據(jù)課題組的甜菊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)擬通過(guò)同源克隆的方法在甜菊中獲得DREB亞家族A-1亞組基因，另外通過(guò)亞細(xì)胞定位和轉(zhuǎn)錄激活活性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)基因功能進(jìn)行研究，為以后通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段獲得耐寒性提高的甜菊植株奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與種植條件

實(shí)驗(yàn)所用的‘中山6號(hào)’甜菊植株保存于江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所甜菊種質(zhì)資源圃。用于亞細(xì)胞定位的煙草植株種植于小方盆中（營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石=2∶1），放于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光周期為16 h光照，8 h黑暗，晝夜溫度為23℃/18℃，光照強(qiáng)度為80～100 μmol/(m2·s)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取及基因全長(zhǎng)克隆

取生長(zhǎng)在資源圃的‘中山6號(hào)’甜菊葉片，速凍于液氮中，然后-80℃保存，用于RNA提取。利用TAKARA公司Trizol提取RNA步驟進(jìn)行甜菊葉片總RNA提取。RNA的反轉(zhuǎn)錄采用TAKARA公司的PrimeScript 1stStrand cDNA Synthesis Kit（D6110A）并依據(jù)試劑盒操作步驟進(jìn)行mRNA的反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

表1 研究所用PCR引物Table 1 The PCR primers used in thisstudy

根據(jù)課題組已有的‘中山6號(hào)’不同發(fā)育時(shí)期葉片的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，利用擬南芥AtDREB1A（NCBI登錄號(hào)為ABD42992）基因序列進(jìn)行同源性查找，得到兩條相似性最高的基因序列，將這兩條序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因全長(zhǎng)比對(duì)，然后設(shè)計(jì)基因全長(zhǎng)引物SrDREB1A1-F/R和SrDREB1A2-F/R進(jìn)行全長(zhǎng)克?。ㄒ镄蛄幸?jiàn)表1），全長(zhǎng)克隆的高保真酶選用TOYOBO公司的KOD，并按照說(shuō)明書(shū)上步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增得到的片段構(gòu)建在TAKARA公司的pMD19-T載體上，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α并涂布于含有氨芐抗性的平板上，過(guò)夜培養(yǎng)。挑取生長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，然后選取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，進(jìn)而得到基因全長(zhǎng)序列。

1.2.2 進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建及結(jié)構(gòu)域分析

在NCBI網(wǎng)站上下載與SrDREB1A同源的氨基酸序列，利用MEGA 5.0軟件對(duì)所有序列進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，選擇Neighbor-joining方法，Bootstrap參數(shù)值選擇1 000[15]。另外將SrDREB1A1和SrDREB1A2蛋白序列提交NCBI網(wǎng)站進(jìn)行序列分析，明確保守結(jié)構(gòu)域位置，之后通過(guò)DNAMAN軟件進(jìn)行同源多序列比較，并標(biāo)注保守結(jié)構(gòu)域所在位置。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄激活活性鑒定

選擇合適的帶有酶切位點(diǎn)的接頭引物SrDREB1A1-BD-F/R和SrDREB1A2-BD-F/R（引物序列見(jiàn)表1）對(duì)構(gòu)建在pMD19-T上的目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)對(duì)pGBKT7空載體進(jìn)行雙酶切，然后通過(guò)重組方法將SrDREB1A1和SrDREB1A2構(gòu)建在pGBKT7載體上。轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α后，挑選陽(yáng)性克隆送公司測(cè)序。應(yīng)用Clontech酵母轉(zhuǎn)化試劑盒將SrDREB1A1-BD、SrDREB1A2-BD、BD空載陰性對(duì)照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2H感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于缺陷培養(yǎng)基SD/-Trp上。30℃倒置培養(yǎng)2～3 d后，挑取單克隆菌落，在0.9%NaCl溶液中打散后吸取相同體積的菌液點(diǎn)于SD/-His-Ade和SD/-His-Ade+X-α-gal培養(yǎng)基上。30℃倒置培養(yǎng)2～3 d后觀察菌落生長(zhǎng)和顯色情況并拍照記錄。

1.2.4 亞細(xì)胞定位

選擇合適的帶有酶切位點(diǎn)的接頭引物SrDREB1A1-GFP-F/R和SrDREB1A2-GFP-F/R（引物序列見(jiàn)表1）對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行擴(kuò)增，然后通過(guò)同源重組的方法將SrDREB1A1和SrDREB1A2構(gòu)建在pCAMBIA1305-GFP載體上。將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株EHA105。挑取陽(yáng)性農(nóng)桿菌菌落至含有卡納和利福平的LB液體培養(yǎng)基中，28℃震蕩培養(yǎng)至OD值達(dá)到1.0左右。吸取400μL菌液與等量的P19菌液混合，離心后用重懸液充分懸浮菌體，并在室溫放置2～4 h。用1 mL去針頭的注射器吸取適量菌液，從煙草葉片的背部小心注射到葉肉組織中。煙草正常培養(yǎng)2～3 d后，用雙面刀片切取注射部位葉片，倒置放于載玻片上并用激光共聚焦顯微鏡（LSM 700,Carl Zeiss）觀察熒光發(fā)生情況[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SrDREB1As基因克隆與結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)同源克隆方法我們?cè)谔鹁罩蝎@得了兩個(gè)DREB類(lèi)基因。進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因都屬于A-1亞組，分別與紫荊澤蘭和菊花中的CBF及DREB1A親緣關(guān)系最近，因此將其分別命名為SrDREB1A1和SrDREB1A2（圖1A）。結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)SrDREB1A1和SrDREB1A2均具有一個(gè)典型的AP2結(jié)構(gòu)域（圖1B）。SrDREB1A1ORF全長(zhǎng)660 bp，編碼219個(gè)氨基酸殘基，通過(guò)BioXM軟件預(yù)測(cè)的蛋白分子量為24.58 kDa，等電點(diǎn)為5.42。SrDREB1A2ORF全長(zhǎng)630 bp，編碼209個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)的蛋白分子量和等電點(diǎn)分別為23.21 kDa和5.41。

圖1 SrDREB1A1和SrDREB1A2進(jìn)化樹(shù)（A）和結(jié)構(gòu)域分析（B）Fig.1 Phylogenetic analysis(A)and domain comparison(B)of SrDREB1A1 and SrDREB1A2

2.2 SrDREB1A1和SrDREB1A2轉(zhuǎn)錄激活活性分析

為了鑒定其轉(zhuǎn)錄活性，分別將SrDREB1A1-BD和SrDREB1A2-BD載體轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞中。在SD/-His-Ade缺陷培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化SrDREB1A1-BD和SrDREB1A2-BD的酵母細(xì)胞生長(zhǎng)良好，并且能在添加X(jué)-α-gal的培養(yǎng)基上顯藍(lán)色，而轉(zhuǎn)BD空載體的陰性對(duì)照的菌落則不能正常生長(zhǎng)（圖2）。以上結(jié)果表明，SrDREB1A1和SrDREB1A2均具有轉(zhuǎn)錄激活活性。因此這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在甜菊植株體內(nèi)可能是通過(guò)激活下游脅迫響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控耐寒性。

圖2 SrDREB1A1和SrDREB1A2轉(zhuǎn)錄激活活性分析Fig.2 Transactivation activity analysis of SrDREB1A1 and SrDREB1A2

2.3 SrDREB1A1和SrDREB1A2亞細(xì)胞定位

轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)核對(duì)其行使轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能具有重要的作用。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化GFP空載體的煙草葉片細(xì)胞在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都可以觀察到綠色熒光信號(hào)的產(chǎn)生，而轉(zhuǎn)化SrDREB1A1-GFP和SrDREB1A2-GFP載體的煙草葉片只在細(xì)胞核中特異地觀察到綠色熒光信號(hào)（圖3）。以上結(jié)果表明，SrDREB1A1和SrDREB1A2主要定位在細(xì)胞核，具有典型轉(zhuǎn)錄因子的功能。

圖3 SrDREB1A1和SrDREB1A2的亞細(xì)胞定位Fig.3 Subcellular localization of SrDREB1A1 and SrDREB1A2

3 討論

開(kāi)展甜菊耐寒性的研究對(duì)于進(jìn)一步擴(kuò)大甜菊的種植區(qū)域及延長(zhǎng)寒冷地區(qū)甜菊的生育期都具有重要作用，然而目前關(guān)于這方面的研究較少，并且主要集中在栽培措施的改善及生理指標(biāo)的測(cè)定等方面，例如，湯其坤利用重離子輻照方法篩選甜菊耐寒性品系，發(fā)現(xiàn)低溫條件下甜菊幼苗抗氧化酶活性可作為評(píng)價(jià)耐寒性的生理指標(biāo)，并得到了兩個(gè)耐寒性較好的單株[17]。楊敬敏等用60Co-γ和離子束注入甜菊5個(gè)雜交組合F1代種子，發(fā)現(xiàn)誘變處理有助于選育耐寒甜菊品種[18]。孫廷甲等發(fā)現(xiàn)河西走廊地區(qū)早春凍害會(huì)導(dǎo)致甜菊葉片及莖間末梢組織受損、根系發(fā)育受阻從而導(dǎo)致葉片及地上部干物質(zhì)量明顯減少，并且提出了一些具體的防控措施，包括：增施磷酸二氫鉀底肥、移栽前后及時(shí)灌水、中耕培土和煙熏升溫防凍等[19]。除了這些農(nóng)藝措施外，Peynevandi等還發(fā)現(xiàn)外源施加多胺可以提高甜菊的耐低溫能力[20]。然而隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，通過(guò)分離相關(guān)抗性基因、分析抗性機(jī)理及通過(guò)基因編輯技術(shù)等手段獲得遺傳改良的甜菊新種質(zhì)必將成為以后的發(fā)展方向。因此本研究首次在甜菊中克隆了正向調(diào)控耐寒性的基因SrDREB1A1和SrDREB1A2，并對(duì)它們與其他物種的同源性進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與紫荊澤蘭及菊花的DREB1A類(lèi)親緣關(guān)系較近，紫荊澤蘭和菊花都屬于菊科植物，相比于擬南芥和水稻而言在遺傳關(guān)系上與甜菊的關(guān)系較近，因此表明聚類(lèi)分析的準(zhǔn)確性。A-1亞組基因在多個(gè)物種中均可提高植株的耐寒性[21-22]，表明此類(lèi)基因的功能保守性，也暗示SrDREB1A1和SrDREB1A2可正向調(diào)控甜菊的耐寒性。SrDREB1A1和SrDREB1A2均具有轉(zhuǎn)錄激活活性并且定位在細(xì)胞核，表明它們具有典型的轉(zhuǎn)錄因子功能，并且可能通過(guò)直接結(jié)合下游目標(biāo)基因的啟動(dòng)子序列進(jìn)而激活其表達(dá)，從而達(dá)到正向調(diào)控甜菊耐寒性的效果。本研究構(gòu)建的pCAMBIA1305-GFP-SrDREB1As載體是由35 S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，因此也可作為之后轉(zhuǎn)基因的表達(dá)載體使用。綜上，本研究克隆了2個(gè)正向調(diào)控甜菊耐寒性的DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，為以后甜菊耐寒性分子育種提供候選基因資源，具有十分重要的理論與實(shí)際研究意義。