陳 鑫， 李然紅， 劉 丹， 王立鳳， 劉思言

(牡丹江師范學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157012)

鋅是植物必需的微量營養(yǎng)元素之一，鋅指蛋白(Zinc finger proteins，ZFP)主要由半胱氨酸和組氨酸殘基與Zn2+結(jié)合成立體結(jié)構(gòu)[1]，且具有指狀結(jié)構(gòu)特征，RING-ZFPs是典型的鋅指結(jié)構(gòu)蛋白類型，具有保守結(jié)構(gòu)域[2]?，F(xiàn)已知鋅指蛋白廣泛分布在真核生物體中，在擬南芥植物中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有176 種Cys 2 His 2型鋅指蛋白[3]。低溫、干旱等逆境脅迫能夠誘導(dǎo)植物體內(nèi)一些鋅指蛋白基因發(fā)揮作用增強植物逆境脅迫能力。狗棗獼猴桃〔Actinidiakolomikta(Maxim.et Rupr.) Maxim.〕主要分布于我國東北、四川、河北、云南等地。其葉片顏色在生長的不同時期會發(fā)生變化，形成白色或紫紅色彩葉，遠觀如桃花盛開又如梨花片片，極具觀賞價值，其果實柔軟多汁、酸甜可口、富含維生素C，是一種藥食觀賞兼用植物[4-6]，屬于大型落葉藤本植物。RING型基因能夠在擬南芥、煙草、辣椒、草莓、水稻等多種植物中鑒定出來，并在植物的生長發(fā)育、激素的信號傳導(dǎo)及響應(yīng)非生物脅迫等方面起到關(guān)鍵作用。KO等[7]研究表明,在擬南芥超表達RING時能夠引起耐鹽性的降低;GAO等[8]通過調(diào)節(jié)RING型基因改變ABA信號傳導(dǎo)可以提高水稻的抗旱性；CHAE等[9]發(fā)現(xiàn)沉默CaAIRF1基因后的辣椒其ABA敏感性降低，干旱耐受性減弱。另外，LEE等[10]研究發(fā)現(xiàn),擬南芥中的RING型基因表達變化時，其植株的凍害敏感性也發(fā)生變化。高溫處理下植物葉肉細胞中的RING型基因能夠調(diào)控H2O2的積累，進而提高植物的耐高溫性[11]。目前，狗棗獼猴桃CHY基因的研究未見報道。因此，以狗棗獼猴桃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為參考，篩選到狗棗獼猴桃鋅指蛋白(AkCHY)的cDNA序列，利用生物信息學(xué)方法對狗棗獼猴桃蛋白的理化性質(zhì)、疏水性/親水性、結(jié)構(gòu)功能域、蛋白質(zhì)修飾位點及同源性等方面進行預(yù)測和分析，為狗棗獼猴桃鋅指蛋白(AkCHY)功能的研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料

狗棗獼猴桃AkCHY基因cDNA序列從牡丹江師范學(xué)院植物分子育種實驗室轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得；中華獼猴桃變種(Actinidiachinensisvar.chinensis PSS 14254.1)、茶樹(CamelliasinensisXP_028125452.1)、毛果楊(PopulustrichocarpaXP_002314304.1)、胡楊(PopuluseuphraticaXP_011032318.1)、橡膠樹(HeveabrasiliensisXP_021692080.1)、川桑(MorusnotabilisXP_024022996.1)、榴蓮(DuriozibethinusXP_022730070.1)、麻瘋樹(JatrophacurcasXP_012064689.1)、大桉(EucalyptusgrandisXP_010031414.1)、葡萄(VitisviniferaRVW54207.1)、番木瓜(CaricapapayaXP_021908000.1)、棗樹(ZiziphusjujubaXP_015898513.1)、歐洲栓皮櫟(QuercussuberXP_023888973.1)、木薯(ManihotesculentaOAY51516.1)、石榴(PunicagranatumOWM68934.1)等15種植物氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載。

1.2 方法

AkCHY的理化性質(zhì)用ProtParam(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/ protparam)進行分析；NCBI-CDD進行保守結(jié)構(gòu)域及蛋白家族預(yù)測(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/)；Inter-ProtScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)預(yù)測功能位點；NetPhos3.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)對N-糖基化位點進行預(yù)測；NetOGlyc(http://www.cbs.dtu.dk/ services/NetOGlyc/)對O-糖基化位點進行預(yù)測；采用PredictProtein 數(shù)據(jù)庫(https://www.predictprotein.org/)對AkCHY進行二級結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)修飾位點預(yù)測；使用 SWISS-MODEL(http://swissmodel.Expasy.org/)在線軟件預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中獲得15條不同植物的CHY氨基酸序列信息，利用MEGA 5.1的Neighbor-joining法構(gòu)建蛋白質(zhì)系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 AkCHY的理化性質(zhì)

經(jīng)分析表明，AkCHY基因cDNA全長為1 768 bp，編碼區(qū)(CDS)為cDNA上第238～1 074個堿基，共編碼279個氨基酸，分子量32 324.16 D，理論等電點為7.01，負電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)為37，正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為36，分子式為C1369H2125N413O407S45，總原子數(shù)4 359，不穩(wěn)定指數(shù)(instability index,Ⅱ)為54.356，脂肪系數(shù)(Aliphatic index)為54.44，親水性(GRAVY)的平均水平為-0.527。說明該蛋白為親水非穩(wěn)定性蛋白。該蛋白中含量最多的為半胱氨酸，占11.8%；其次為組氨酸，占7.5%；含量最少的為色氨酸，為0.4%(圖1)，吡咯賴氨酸及硒半胱氨酸含量為0。通過ProtScale分析預(yù)測(圖2)，該基因蛋白的整個肽鏈中均含有親水性和疏水性氨基酸，得分最大值為1.967，在158個氨基酸處；最小值為-2.522，在第59個氨基酸處。從整體分布看，氨基酸的負值多且分值大，根據(jù)蛋白質(zhì)親水和疏水的得分判定該蛋白為親水蛋白。結(jié)合理化性質(zhì)分析得出該AkCHY基因為非穩(wěn)定親水蛋白。

圖1 AkCHY基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸組成

Fig.1 Amino acid compositions of protein encoded by theAkCHYgene

圖2 AkCHY的親水/疏水性

Fig.2 Hydrophilicity/hydrophobicity analysis of AkCHY

2.2 AkCHY的信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)

經(jīng)SignalP-4.1預(yù)測AkCHY蛋白不含信號肽(圖3)，同時不存在跨膜結(jié)構(gòu)。

注：C值、S值和Y值分別是原始剪切位點、信號肽和綜合剪切位點的分值。

Note:The C value,S value and Y value were the scores of original shear site,signal peptide and comprehensive shear site respectively.

圖3 AkCHY的蛋白信號肽

Fig.3 Signal peptide of AkCHY

2.3 AkCHY的結(jié)構(gòu)域

對AkCHY保守序列及蛋白家族預(yù)測(圖4)表明,AkCHY是ZFP基因家族的ZF-CHY和zinc-ribbon-6成員(ID：11342810)，第18～100個氨基酸的序列區(qū)域為ZF-CHY組的保守結(jié)構(gòu)域，第201～259個氨基酸的序列區(qū)域含有zinc-ribbon-6的鋅帶結(jié)構(gòu)。另外，152～204個氨基酸存在RING-H2-Pirh2、RING-H2、RING-H2-BRAP2、HRD1、RING-H2-RNF24、COG5540、RING-Ubox等保守結(jié)構(gòu)域。

圖4 AkCHY的蛋白保守序列

Fig.4 Conservative protein sequence of AkCHY

2.4 AkCHY的二級、三級結(jié)構(gòu)

對AkCHY的二級結(jié)構(gòu)進行分析預(yù)測，該蛋白14%可能會形成螺旋，10%可能形成延伸鏈，76%為無規(guī)卷曲，無二硫鍵的形成，無特殊的二級結(jié)構(gòu)。用SWISS-MODEL對AkCHY蛋白進行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測(圖5)，該三級結(jié)構(gòu)含有多個功能結(jié)構(gòu)域，在第202～263個氨基酸的序列區(qū)域含有zinc-ribbon-6的鋅帶結(jié)構(gòu)域，第5～146個和第147～238個氨基酸均有RING-H2保守結(jié)構(gòu)。

圖5 AkCHY蛋白的三級結(jié)構(gòu)

Fig.5 Tertiary structure prediction of AkCHY protein

2.5 AkCHY的蛋白質(zhì)修飾位點

對蛋白磷酸化位點預(yù)測，該蛋白存在磷酸化位點18個(圖6)。對O-糖基化位點進行預(yù)測，預(yù)測分數(shù)均大于0.5，因此未陽性，故推測該蛋白內(nèi)含5個O-糖基化位點分別在第3、48、265、268、267個氨基酸。由表1可見，AkCHY含有2個蛋白激酶磷酸化位點分別在第13、164個氨基酸處，4個酪蛋白磷酸激酶II磷酸化位點分別在第3、74、164、199個氨基酸處，4個十四烷?；稽c分別在第86、115、132、263個氨基酸處。

2.6 AkCHY的氨基酸序列同源性

AkCHY氨基酸序列與15種植物的CHY序列進行同源性分析(圖7)表明，狗棗獼猴桃與中華獼猴桃原變種的親緣關(guān)系較近，而與番木瓜等植物的親緣關(guān)系較遠。

圖6 AkCHY蛋白的磷酸化位點

Fig.6 Phosphorylation site prediction of AkCHY protein

表1 AkCHY的修飾位點

圖7 CHY系統(tǒng)進化樹

Fig.7 System phylogenetic tree of CHY

3 結(jié)論與討論

鋅指蛋白作為真核生物中分布最廣泛的基因調(diào)控因子，直接或間接參與植物的生長發(fā)育、根系建成、逆境響應(yīng)及信號調(diào)節(jié)等生理生化過程，根據(jù)半胱氨酸和組氨酸殘基的數(shù)目和位置分為C2H2、C4、C6、C4HC3等多種類型，根據(jù)功能結(jié)構(gòu)分為PHD、DOF、RING型，在植物中具有高度保守基因序列。CHY基因含有RING型結(jié)構(gòu)功能，與植物生長發(fā)育及非生物脅迫抗性功能相關(guān)，擬南芥中發(fā)現(xiàn)的RING型鋅指蛋白基因與植物側(cè)根發(fā)育有密切關(guān)系，同時還具備抗旱能力[12]。研究通過生物信息學(xué)方法得到AkCHY基因的基本理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)功能：該基因cDNA全長為1 768 bp，由279個氨基酸編碼構(gòu)成，通過理化性質(zhì)及ProtScale分析出該蛋白為非穩(wěn)定親水性蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)，二級結(jié)構(gòu)主要構(gòu)件為α-螺旋和不規(guī)則卷曲，三級結(jié)構(gòu)中包含RING型結(jié)構(gòu)及zinc-ribbon-6的鋅帶結(jié)構(gòu)域，選取15條CHY氨基酸序列與AkCHY進行比對，經(jīng)MAGA5.1分析，狗棗獼猴桃與中華獼猴桃原變種的親緣關(guān)系較近，而與番木瓜等植物的親緣關(guān)系較遠。研究結(jié)果為進一步研究狗棗獼猴桃鋅指蛋白CHY基因功能提供理論基礎(chǔ)。