劉永錄， 李艷玲， 郭振環(huán)， 馬 霞*， 王 林， 張國祖

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院， 河南 鄭州 450011； 2. 河南省康星生物科技有限公司， 河南 焦作 454950； 3.河南省康星藥業(yè)股份有限公司， 河南 鄭州451464)

超微粉碎技術(shù)是指利用機械或流體動力的方法，將物料顆粒粉碎至微米級甚至納米級微粉的過程。中藥微粉碎利用機械或流體動力將中藥材顆粒粉碎到粒徑為微米級或納米級，使中藥細胞破壁率達90%以上，可充分釋放細胞內(nèi)的有效成分，使其可直接接觸溶劑，從而提高藥材的生物利用度[1-2]，達到更好的用藥效果。但中藥材經(jīng)超微粉碎后，細胞壁被打破，中藥材的微觀特征已被徹底破壞，傳統(tǒng)的中藥材鑒別方法已不再適用，有必要找到一個更有效的方法來控制中藥微粉的質(zhì)量。

益母草是獸醫(yī)臨床上常用的中藥，在2012年中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第1773號中被列入《飼料原料目錄》，其具有活血調(diào)經(jīng)、安胎止痛等功效，可以用于母畜不孕、產(chǎn)后惡露不止等癥的治療[3-4]。為使益母草的功效發(fā)揮最大，將其制備成微粉。經(jīng)超微粉碎后可加速其有效成分的溶出速度，增強療效。但目前還沒有針對益母草微粉質(zhì)量研究的文獻報道。因此，筆者對益母草微粉進行薄層色譜(TLC)鑒別，并使用激光粒度分析儀對其粒徑進行檢測，同時采用高效液相色譜(HPLC)法測定益母草堿的含量并制定含量限度，以期為益母草微粉飼料原料的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗樣品：10批300目益母草微粉樣品，河南省康星藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。

儀器與試劑：LRVM-MHS-BE 型高頻震動研磨機(山東龍脈科技發(fā)展有限公司)， Winner3003 型智能型激光粒度分析儀(濟南微納顆粒儀器股份有限公司)，1100 型HPLC 儀(美國Agilent 公司)，AUW220D型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。鹽酸水蘇堿對照品(含量以99.6%計，批號110712-201111，中國生物制品檢定所)，鹽酸益母草堿對照品(含量以94.7%計，批號111823-201202，中國生物制品檢定所)，甲醇(上海試劑一廠)，乙腈(天津市四友精細化學(xué)品有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 薄層鑒別

1) 對照品溶液的制備。取鹽酸水蘇堿對照品，加無水乙醇制成濃度為1 mg/mL的溶液，即為對照品溶液。

2) 供試品溶液的制備。精密稱取益母草微粉樣品1 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，記錄重量，加熱回流2 h，放冷至室溫，再次稱重，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，過濾取濾液，即得。

3) 點樣和展開。分別吸取對照品溶液及供試品溶液10 μL，各點于同一硅膠G薄層板上，以丙酮-無水乙醇-鹽酸(10∶6∶1)為展開劑展開，取出，晾干，在105℃加熱15 min后放冷至室溫，噴以稀碘化鉍鉀試液-三氯化鐵試液(10∶1)混合溶液至斑點顯色清晰。

1.2.2 益母草微粉粒徑的檢測 選用Winner3003干粉激光粒度儀，對10批益母草微粉樣品進行粒徑分布檢測。取適量樣品置于激光粒度分析儀的樣品槽中，使樣品平鋪均勻。操作粒度分析儀上吸塵、送氣、進樣，激光粒度分析儀自動測量出粒徑分布及結(jié)果。

1) 儀器的精密度考察。取標樣金剛砂重復(fù)進樣6次，檢測粒徑分布，統(tǒng)計D50(指50%的顆粒小于某個粒徑值)和D90的RSD，考察儀器精密度。

2) 水分的考察。取含水量分別為5.7%、6.3%、7.7%和8.6%的益母草微粉進行粒徑分布檢測，統(tǒng)計<48 μm和>75 μm粒徑分布情況。

3) 重復(fù)性考察。取同一批次益母草微粉重復(fù)進樣6次，測定粒徑分布，統(tǒng)計<48 μm和>75 μm粒徑分布，計算RSD。

4) 穩(wěn)定性試驗。取同一批次益母草微粉分別在1 h、3 h、6 h、9 h、12 h及24 h進樣測定其粒徑分布。

5) 10批藥材樣品的粒度檢測。取10批藥材制備的益母草微粉，每批分別進樣3次進行檢測，統(tǒng)計結(jié)果，確定<48 μm粒子所占的百分比限度和>75 μm粒子所占百分比限度[5]。

1.2.3 益母草堿含量的測定

1) 色譜條件與系統(tǒng)適用性考察。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈0.4%辛烷磺酸鈉的0.1%磷酸溶液(24∶76)為流動相,檢測波長為277 nm。理論板數(shù)按鹽酸益母草堿峰計算應(yīng)不低于6 000。

2) 對照品溶液的制備。精密稱定鹽酸益母草堿對照品5.68 mg，置于200 mL量瓶中，加70%乙醇溶劑并定容至刻度，制成每1 mL含30 μg的溶液，即得。

3) 供試品溶液的制備。精密稱取益母草微粉1 g，放入具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱定重量，加熱回流2 h后放冷至室溫，再稱量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，過濾，取濾液，即得。

4) 專屬性考察。分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，進樣，在前述色譜條件下進行測定。

5) 線性關(guān)系考察。分別精密吸取對照品溶液5 μL、8 μL、10 μL、15 μL和20 μL注入液相色譜儀，測定峰面積，將所得到的峰面積與對照品進樣質(zhì)量進行線性回歸。

6) 樣品的含量測定。分別對十批不同藥材來源制成的益母草微粉按照上述建立的方法處理，測定益母草微粉中益母草堿的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄層鑒別

從圖1可知，在與對照品相對應(yīng)的位置供試品均出現(xiàn)了相應(yīng)的紅色斑點，空白溶劑未出現(xiàn)干擾，表明，該方法能有效鑒別出益母草微粉中的鹽酸水蘇堿成分。

注：1，水蘇堿；2～4，益母草微粉樣品；5，空白溶劑對照

Note:1, stachydrine; 2-4,L.heterophyllusmicropowder samples; 5, blank solvent control

圖1益母草微粉薄層鑒別

Fig.1 TLC identification ofL.heterophyllusmicropowder

2.2 益母草微粉的粒徑

2.2.1 儀器的精密度 從表1可知，金剛砂的D50平均值為25.83 μm，在標準值(26±0.7)μm的范圍內(nèi)，且D50的RSD為0.69%。D90的平均值為37.50 μm，RSD為1.65%。表明，Winner3003干粉激光粒度儀的精密度良好。

表1 益母草微粉粒徑測定的精密度及重復(fù)性

Table 1 Precision and repeatability of particle size determination ofL.heterophyllusmicropowder

μm

注：D50和D90的RSD分別為0.69%和1.65%。

Note:RSDs of D50and D90were respectively 0.69% and 1.65%.

2.2.2 水分 從表2可知，益母草微粉不同含水量(5.7%～8.6%)<48 μm的平均粒徑為98.35%，RSD為0.56%，差異不顯著。說明水分在9.0%之下對粒徑檢測結(jié)果影響不大，但水分大于9.0%時，微粉易結(jié)塊、儀器易堵塞，對檢測結(jié)果影響較大。

表2 益母草微粉不同含水量樣品的粒徑分布比例

Table 2 Particle size distribution ratio ofL.heterophyllusmicropowder with different moisture content

%

2.2.3 重復(fù)性試驗 從表3可知，<48 μm的粒徑分布平均為99.09%，RSD為0.31%。說明該方法的重復(fù)性良好，滿足粒徑測定要求。

表3 益母草微粉粒徑測定的重復(fù)性

Table 3 Repeatability of particle size determination ofL.heterophyllusmicropowder

編號No.<48 μm粒徑分布<48 μm particle distribution>75 μm粒徑分布>75μm particle distribution199.550.03299.060.14399.030.12498.580.26599.110.12699.190.11平均 Mean99.090.13RSD0.31-

2.2.4 穩(wěn)定性 從表4可知，24 h內(nèi)<48 μm的粒徑分布平均值為98.37%，RSD為0.43%。表明供試品粒徑在室溫條件下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表4 益母草微粉粒徑測定的穩(wěn)定性

Table 4 Stability of particle size determination ofL.heterophyllusmicropowder

%

2.2.5 10批藥材樣品的粒經(jīng) 從表5可知，10批樣品的粒經(jīng)小于48 μm顆粒百分比為97.83%～99.63%，平均值為 98.61%，RSD為0.75%；大于75 μm顆粒百分比為0.05%～0.50%，平均值為0.26%。根據(jù)取整數(shù)原則，將益母草微粉粒徑的上限設(shè)定為小于48 μm顆粒百分比不低于95%，而上限定為大于75 μm顆粒百分比不超過1.0%較為適宜。

表5 10批益母草微粉的粒徑檢測結(jié)果

Table 5 Particle size distribntion ratio of 10 batches ofL.heterophyllusmicropowder %

批次Batch No.<48 μm顆粒的占比<48 μm proportion>75 μm顆粒的占比>75 μm proportion1607020199.530.051607020297.830.501607030197.880.451607030299.190.051607040197.920.491607040298.380.191607050199.630.061607050299.400.091607060198.050.431607060298.270.27平均 Mean98.610.26限度Limitation951

2.3 益母草堿的含量

2.3.1 專屬性 在供試品色譜中，對照品位置相同保留時間出現(xiàn)了益母草堿峰，說明該方法專屬性良好。

2.3.2 線性關(guān)系 經(jīng)測定，峰面積與對照品進樣質(zhì)量的線性回歸方程為y=1 482.8x-21.076，R= 0.999 6。表明鹽酸益母草堿進樣量在0.15～0.60 μg時，進樣量與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.3 樣品的含量測定 從表6可知，10批益母草微粉的益母草堿含量變幅為0.073%～0.081%，平均值為0.077%。根據(jù)獸藥有效成分含量限度制定原則，選取10批不同藥材來源樣品均值的80%作為最低限度，即益母草堿的含量應(yīng)不低于0.06%，即益母草微粉含益母草堿不得少于0.60 mg/g。

表6 10批益母草微粉益母草堿的含量

Table 6 Content ofL.heterophyllusalkaloid in ten batches ofL.heterophyllusmicropowder

批號Batch No.含量/% Content批號Batch No.含量/% Content160702010.073160704020.081160702020.074160705010.078160703010.077160705020.077160703020.079160706010.075160704010.081160706020.075

3 結(jié)論與討論

試驗表明，在薄層圖譜中，供試品在對照品斑點位置出現(xiàn)相應(yīng)斑點，且無干擾，可用于益母草微粉的鑒別；益母草微粉粒徑的上限為小于48 μm顆粒百分比不低于95%，下限為大于75 μm顆粒百分比不超過1.0%。HPLC檢測中，益母草堿的進樣量為0.15～0.60 μg時，進樣量與峰面積線性關(guān)系良好(r=0.999 6)；10批樣品的益母草堿含量變幅為0.073%～0.081%，平均為0.077%。建議控制益母草飼料原料中益母草微粉含益母草堿不少于0.60 mg/g。

含量測定方法首要參考了2015版《中華人民共和國獸藥典》[6]，采用高效液相色譜法分別從稱樣量、稀釋倍數(shù)和進樣量等方面進行優(yōu)化，獲得了穩(wěn)定準確的含量測定方法；可以認為，益母草微粉中益母草堿含量不低于0.06%即為合格，所以益母草堿可作為其質(zhì)量控制的定量指標。

粒徑檢測是區(qū)別于傳統(tǒng)散劑的一個重要手段。微粉的粒度檢查采用激光衍射法，參考《中華人民共和國獸藥典》2015年版一部粒度和粒度分布測定法第3法(光散射法)[7]，選用的檢測儀器為Winner 3003干粉激光粒度儀。干法檢測適用于一切粉體顆粒，不受顆粒物理、化學(xué)性質(zhì)的限制，不僅適用于在液體中發(fā)生形狀變化、發(fā)生化學(xué)反應(yīng)或損失其成分的顆粒，還適用于磁性顆粒。藥典上規(guī)定的細粉、最細粉和極細粉均標明通過相應(yīng)目數(shù)篩網(wǎng)的比例不少于95%。益母草微粉的粒度為300目(48 μm)，因此將粒徑標準定為小于48 μm的粒子不少于95%。200目對應(yīng)的粒徑大小為75 μm，因此將大于75 μm的粒子作為粒徑的上限。