易紹金，邢燕青，余 燦

（長江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北荊州434023）

反硝化菌（denitrifying bacteria，簡稱DNB）是一群能在厭氧條件下將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽進而還原成氮氣的一類細菌的總稱［1-4］。DNB 是重要的微生物采油功能菌［5］，也是抑制硫酸鹽還原菌的重要菌群［6-9］，還是污水生物脫氮的主要菌群［10-11］。因此，在微生物采油、反硝化菌抑制硫酸鹽還原菌科學(xué)研究、菌劑產(chǎn)品質(zhì)量檢驗和油田現(xiàn)場監(jiān)控及污水生物脫氮處理等工作過程中，常常需要測定DNB的數(shù)量（濃度）。

目前，測定DNB菌量的主要方法是最大概率數(shù)法（MPN 法）。但是，這種方法存在比較明顯的缺陷。首先，該法操作包括清潔玻璃器皿、培養(yǎng)基的配制與滅菌、分裝等一系列過程極為繁瑣、費時；其次，該法在測定DNB 時要求在厭氧條件下操作，而實際過程中易混入氧氣，對操作條件要求較嚴。因此，工作效率極低的DNB菌量測定方法已經(jīng)遠遠不能滿足現(xiàn)代高效工作的需要，研制更加簡單準確的DNB菌量測定的新方法和新工具迫在眉睫。

孫炳德［12］將細菌測試瓶法用于硫酸鹽還原菌（SRB）菌量的測定，認為細菌瓶測試法在菌量測定中既簡單準確，又方便快捷。易紹金等［13-15］將細菌瓶測試法用于石油烴降解菌、產(chǎn)表面活性劑菌、黃原膠降解菌等相關(guān)細菌菌量測定中，進一步發(fā)展并完善了細菌瓶測試法在相關(guān)細菌菌量測定中的應(yīng)用。細菌瓶內(nèi)裝有SRB等細菌的專用培養(yǎng)基，只能用于測定SRB等細菌，而不能用于測定DNB。為了更簡便準確的測定DNB的菌量，根據(jù)細菌瓶法的基本原理，研制了用于培養(yǎng)DNB的專用測試瓶。在進行了樣品的多次實際測試和不斷改良后，現(xiàn)已形成成熟的反硝化菌測試瓶（DNB-JH型）產(chǎn)品。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

油田產(chǎn)出液，江漢油田；生物抑制菌液、微生物清防蠟菌劑，湖北三雄科技發(fā)展有限公司。STARTER 3100 pH 計，奧豪斯儀器設(shè)備有限公司；SPX-300BS-Ⅱ生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；AX2202ZH/E電子天平，奧豪斯儀器（常州）有限公司；YM型不銹鋼立式電熱蒸汽消毒器，上海三申醫(yī)療器械有限公司；1.0 mL一次性無菌注射器等。

1.2 DNB測試瓶的制備

（1）DNB培養(yǎng)液的配制

比較不同配方培養(yǎng)液培養(yǎng)DNB 的速度優(yōu)選培養(yǎng)液配方。反復(fù)篩選得到了以有機酸鹽為碳源，含有硝酸鹽、磷源和化學(xué)脫氧劑等組分的專門用于培養(yǎng)DNB的培養(yǎng)液配方及其合適的pH值。該配方按照DNB的生理生化特征所設(shè)計，培養(yǎng)出的細菌只是在厭氧條件下將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽進而還原成氮氣的DNB，測試工作不受其他細菌的干擾。

（2）生長指示

為了及時準確地反映培養(yǎng)液中有無DNB 的生長，必須確定易于觀察的生長指示。要求生長指示特異性強，易于判斷。根據(jù)DNB代謝特點和代謝產(chǎn)物確定其生長指示。DNB 的生命活動會使培養(yǎng)液產(chǎn)生渾濁，新陳代謝會產(chǎn)生N2，即培養(yǎng)液變渾變濁并出現(xiàn)肉眼可見的氣泡為DNB的生長指示。

（3）測試瓶制備與滅菌

將配制好的培養(yǎng)液厭氧分裝入標準玻璃瓶（15 mL）中，每瓶裝9.0 mL 培養(yǎng)液，然后用橡膠蓋和鋁蓋封口，再按常規(guī)滅菌，即為DNB測試瓶。

1.3 測試方法

具體測定方法按細菌瓶常規(guī)測定方法進行［13-15］。把接種后的測試瓶放在30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，無菌生長的測試瓶內(nèi)培養(yǎng)液無明顯變化，而有菌生長的測試瓶內(nèi)培養(yǎng)液逐漸變渾變濁并出現(xiàn)肉眼可見的氣泡（N2），一般此過程為3數(shù) 5 d，因此確定5 d 讀數(shù)（即樣品注入測試瓶后培養(yǎng)5 d后的讀數(shù)）。

1.4 計數(shù)

DNB的測定一般采用二次平行管測定方法［16-17］，可根據(jù)表1進行計數(shù)。實際樣品測定時需乘以稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與討論

為了驗證細菌瓶法測定的準確性和可靠性，采用工業(yè)化生產(chǎn)的DNB-JH型測試瓶對多個油田產(chǎn)出液、生物抑制菌液、微生物清防蠟菌劑等樣品中的DNB 數(shù)量進行了測定，并與MPN 法測定結(jié)果進行對比，選擇具有代表性的3 個測定結(jié)果分別列于表2、表3和表4。

表1 二次平行管的細菌最大可能值

表2 某油田采出液中DNB測定結(jié)果（二次平行）

表3 某生物抑菌劑中DNB測定結(jié)果（二次平行）

表4 某微生物清防蠟劑中DNB測定結(jié)果（二次平行）

由表2數(shù)4 可見，細菌瓶法的測定結(jié)果與MPN法基本相同，表明其測試結(jié)果準確可靠。而在表3中，可能是由于氧氣的混入導(dǎo)致MPN 法所測得的DNB 菌數(shù)較細菌瓶法的低，因此，細菌瓶法的測定結(jié)果更為準確。常見的平板菌落計數(shù)法不適用于厭氧細菌菌量的測定。在測定厭氧細菌的菌量時，MPN法在實際操作過程中容易混入氧氣，導(dǎo)致測定結(jié)果不準確。而DNB 細菌瓶法由于在培養(yǎng)液中加入了化學(xué)脫氧劑并采取了隔氧保護措施，因此在用于DNB菌量的測定過程中，所培養(yǎng)出的細菌只是在厭氧條件下將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽進而還原成N2的DNB，測試工作中不會受氧氣和其他細菌的干擾。在判斷測試瓶內(nèi)有無DNB 生長時，有DNB 存在的測試瓶內(nèi)的培養(yǎng)液逐漸變渾變濁并出現(xiàn)肉眼可見的氣泡（N2），生長指示易于觀察，測定結(jié)果更為準確可靠。

3 結(jié)論

細菌瓶法可準確測定樣品中的反硝化菌的菌量，可用于微生物采油研究、采油菌液產(chǎn)品質(zhì)量檢驗（菌量測定）和微生物采油現(xiàn)場監(jiān)控等。與傳統(tǒng)的MPN 法相比，細菌瓶法具有生長指示明顯、操作簡便和工作效率高等優(yōu)點，應(yīng)用前景良好。