鐘亞春，陸 璇，楊 泳，彭文茜，黃 倩

(武漢市第一醫(yī)院甲狀腺乳腺外科 430022)

乳腺癌發(fā)病率高居女性惡性腫瘤的第二位，僅次于宮頸癌，近些年來(lái)，其發(fā)病率尚有年輕化和增高趨勢(shì)[1-3]。手術(shù)聯(lián)合術(shù)后化療是根治乳腺癌的主要方法，但乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)率仍較高，可能是術(shù)前存在腫瘤微轉(zhuǎn)移，這也是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的主要危險(xiǎn)因素[4]。腫瘤細(xì)胞的快速生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性緊密相關(guān)。正常組織中，人體細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡處于一種動(dòng)態(tài)平衡，但腫瘤細(xì)胞理論上可以無(wú)限制復(fù)制，主要原因是腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性可以讓其逃脫機(jī)體免疫系統(tǒng)的殺傷作用。程序性死亡分子1(programmed death-1,PD-1)、程序性死亡配體1(programmed death ligand-1,PD-L1)信號(hào)通路是誘導(dǎo)免疫逃逸的主要機(jī)制之一。有研究顯示在結(jié)直腸癌患者中PD-1可以通過(guò)促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的凋亡，抑制細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞活性，從而抑制機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，達(dá)到腫瘤免疫逃逸的作用[5-9]。本研究旨在探討乳腺癌組織中PD-1介導(dǎo)的免疫信號(hào)通路及作用，為后續(xù)臨床干預(yù)提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般方法 2017年6月至2018年6月收集本院收治的乳腺癌患者92例，納入標(biāo)準(zhǔn)：乳腺癌(診斷依據(jù)為病理)；無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；年齡18～65歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：復(fù)發(fā)性乳腺癌；術(shù)前檢查發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；感染；術(shù)前接受放化療等；肝腎、心腦肺等重大疾?。缓喜⑵渌麗盒阅[瘤；失訪。本研究征得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得所有患者知情同意。92例乳腺癌患者中，年齡38～65歲，平均(51.28±6.74)歲，TNM分期為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期的分別為22、43、27例，直徑1.2～7.5 cm，平均(4.21±1.49)cm，腫瘤細(xì)胞分化程度為高、中、低的分別為54、28、10例，導(dǎo)管癌、小葉癌分別62和30例，Her-2陽(yáng)性的43例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例。

1.2數(shù)據(jù)收集 檢測(cè)PD-1、PD-L1、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)。分析PD-1、PD-L1、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、Treg與乳腺癌患者臨床特征(年齡、TNM分期、直徑、腫瘤細(xì)胞分化程度)的相關(guān)性。

1.3檢測(cè)方法 (1)PD-1、PD-L1:擇期行乳腺癌根治術(shù)，術(shù)中取得乳腺癌組織和癌旁組織標(biāo)本，行免疫組織化學(xué)法檢測(cè)，相關(guān)抗體、DAB顯色試劑盒、ElivisionTMplus試劑盒由福建邁新生物技術(shù)有限公司統(tǒng)一提供。計(jì)分方式：包括染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比兩項(xiàng)，深褐色(3分)、黃色(2分)、淺黃色(1分)和無(wú)色(0分)；陽(yáng)性細(xì)胞百分比大于60%(3分)、>30%～60%(2分)、>0～30%(1分)和0(0分)；兩個(gè)計(jì)分項(xiàng)目的和為總分，總分為2～6分即認(rèn)為陽(yáng)性，否則認(rèn)為陰性。(2)CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞和Treg：取相應(yīng)組織制作細(xì)胞懸液，分離淋巴細(xì)胞(密度梯度離心法)，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，加入單克隆抗體，室溫反應(yīng)30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)(美國(guó)Beckman coulter公司Epics XL型流式細(xì)胞儀)。

2 結(jié) 果

2.1乳腺癌組織和癌旁組織PD-1免疫信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)差異 與癌旁組織比較，乳腺癌組織PD-1、PD-L1、Treg、CD4+T淋巴細(xì)胞表達(dá)增高，而CD8+T淋巴細(xì)胞表達(dá)降低(P<0.01)。見表1。

2.2年齡與PD-1免疫信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性 年齡大于或等于50歲與小于50歲的患者乳腺癌組織中PD-1、PD-L1、Treg、CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.3TNM分期與PD-1免疫信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性 與TNM分期為Ⅰ或Ⅱ期的患者比較，Ⅲ期的患者乳腺癌組織PD-1、PD-L1、Treg、CD4+T淋巴細(xì)胞表達(dá)增高，而CD8+T淋巴細(xì)胞表達(dá)降低(P<0.01)。見表3。

表1 乳腺癌組織和癌旁組織PD-1免疫通路相關(guān)指標(biāo)差異

表2 年齡與PD-1免疫通路相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性

表3 TNM分期與PD-1免疫通路相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性

表4 腫瘤直徑與PD-1免疫通路相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性

表5 分化程度與PD-1免疫通路相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性

2.4腫瘤直徑與PD-1免疫信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性 與腫瘤直徑小于5 cm的患者相比，≥5 cm的患者乳腺癌組織PD-1、PD-L1、Treg、CD4+T淋巴細(xì)胞表達(dá)增高，而CD8+T淋巴細(xì)胞表達(dá)降低(P<0.05)。見表4。

2.5分化程度與PD-1免疫通路相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性 中低分化和高分化的患者乳腺癌組織中PD-1、PD-L1、Treg、CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

3 討 論

腫瘤的生物學(xué)特性對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移具有重大影響，這也是不同生物學(xué)特性患者臨床預(yù)后不同的主要原因。本研究探討了PD-1介導(dǎo)的免疫通路在乳腺癌患者發(fā)病和發(fā)展中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中PD-1、PD-L1、Treg、CD4+T淋巴細(xì)胞表達(dá)增高，而CD8+T淋巴細(xì)胞表達(dá)降低(P<0.05)，且與腫瘤直徑、TNM分期有關(guān)。

盡管對(duì)乳腺癌的治療最近取得了一定進(jìn)展，但20%的患者乳腺癌仍然發(fā)生轉(zhuǎn)移和死亡[10-12]。在過(guò)去的幾十年中，分子機(jī)制參與了乳腺癌的轉(zhuǎn)移已經(jīng)被確定，因此各類靶向藥物治療目前日益得到重視。盡管如此，乳腺癌的發(fā)病率和病死率仍高居不下，腫瘤細(xì)胞的免疫逃脫在乳腺癌的發(fā)病和發(fā)展中具有重要意義[13-15]。正常情況下，組織中細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡處于動(dòng)態(tài)平衡，在病理?xiàng)l件下，這種平衡受到破壞，腫瘤的免疫受到諸多因素的影響，其中就有腫瘤細(xì)胞表面分子的改變，從而誘導(dǎo)抑制機(jī)體免疫功能，逃脫免疫系統(tǒng)對(duì)其殺傷作用。PD-1是機(jī)體重要的免疫抑制分子之一，是一種免疫球蛋白，也是一種膜蛋白，由268個(gè)氨基酸殘基組成，第一次在凋亡小鼠T淋巴細(xì)胞雜交瘤2B4.11被克隆出來(lái)。PDL-1則是機(jī)體的一種蛋白質(zhì)，由CD274基因編碼，其主要功能是降低細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(主要由CD8+T淋巴細(xì)胞分化而來(lái))，增加Treg(主要由CD4+T淋巴細(xì)胞受到免疫抑制分子的作用分化而來(lái))，達(dá)到抑制機(jī)體免疫系統(tǒng)的目的[16-17]。乳腺癌組織中的Treg主要由CD4+T淋巴細(xì)胞受到免疫抑制分子的作用分化而來(lái)，具有免疫抑制功能。Treg細(xì)胞在腫瘤組織中的作用目前備受關(guān)注，可以導(dǎo)致免疫抑制、免疫無(wú)功能，促進(jìn)多種癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[18-20]。本研究顯示，乳腺癌組織中PD-1、PDL-1、Treg、CD4+T淋巴細(xì)胞升高，且與腫瘤直徑和TNM分期有關(guān)，說(shuō)明PD-1、PDL-1在乳腺癌組織中的高表達(dá)可以促進(jìn)Treg和CD4+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，導(dǎo)致患者預(yù)后不良。此外，本研究顯示乳腺癌組織中CD8+T淋巴細(xì)胞降低，CD8+T淋巴細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中可分化為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，是殺傷腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，水平降低表明免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷能力下降[21-24]。由此可見PD-1、PDL-1的高表達(dá)還可以通過(guò)抑制CD8+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)，導(dǎo)致其分化為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的能力下降，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。PD-1、PDL-1在乳腺癌組織中的高表達(dá)可能與NF-κB信號(hào)通路被激活有關(guān)[25]。目前以PD-1和PD-L1為靶點(diǎn)的靶向藥物治療和免疫調(diào)節(jié)已經(jīng)在臨床開始嘗試，在卵巢癌、腎癌、宮頸癌、非小細(xì)胞肺癌患者中已經(jīng)被證實(shí)有效[26-29]。因此以PD-1和PD-L1為靶點(diǎn)的靶向藥物治療和免疫調(diào)節(jié)可考慮在乳腺癌患者中進(jìn)行，但是目前尚缺乏進(jìn)一步研究。

綜上所述，PD-1和PD-L1在乳腺癌組織中升高，抑制T淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷，與TNM分期和腫瘤直徑有關(guān)。