王 猛，韓 儉，周 偉，劉曄華，張富花，穆 紅△

(1.天津市第一中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300192；2.蘭州大學(xué)病原生物研究所，蘭州 730000；3.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院感染科研究室，蘭州 730000；4.甘肅省第二人民醫(yī)院消化內(nèi)科，蘭州 730000 )

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是一種能夠定植并侵襲人類胃黏膜上皮的革蘭陰性螺桿菌，在世界范圍內(nèi)感染率超過50%，大部分感染Hp的患者無任何癥狀?，F(xiàn)已確認(rèn)其感染是胃腸道慢性炎癥和消化性潰瘍的主要致病因素，并與胃癌及黏膜相關(guān)性淋巴樣組織(mucosa associated lymphoid tissue，MALT)淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)[1]。1994年WHO癌癥研究中心將HP正式確定為Ⅰ類致癌因子。隨著國內(nèi)外不斷關(guān)注，大量研究現(xiàn)已證實(shí)Hp存在高度的基因多樣性及變異性，并且其特點(diǎn)與一些疾病的進(jìn)展和病程結(jié)局的轉(zhuǎn)歸存在密切關(guān)聯(lián)[2]。因此，研究Hp基因多樣性能為其感染相關(guān)消化道疾病的診治、預(yù)后判斷及預(yù)防提供重要的支持依據(jù)。

近些年國內(nèi)外關(guān)于Hp基因多樣性的研究主要集中于空泡毒素vacA和細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白cagA這兩個(gè)基因[3]。目前，上皮細(xì)胞接觸誘導(dǎo)基因(induced by contact epithelium gene A,iceA)和血型抗原Lewis b結(jié)合黏附基因A(blood group antigen Lewis b binds to the adhesive gene A,babA)也逐漸得到關(guān)注，iceA基因分為iceA1型和iceA2型。有研究認(rèn)為iceA1基因型與消化性潰瘍的發(fā)生發(fā)展關(guān)聯(lián)密切，而iceA2基因型則與慢性胃炎及胃癌有關(guān)。BabA蛋白可輔助Hp通過人血型抗原Lewis B黏附胃上皮細(xì)胞，由babA基因編碼[4]，分為babA1型和babA2型，二者基因序列同源，僅是babA2存在10 bp的插入基因序列，可以形成信號(hào)肽序列的翻譯起始點(diǎn)，故僅有babA2基因型具有生物活性[5]。

目前關(guān)于Hp基因iceA、babA的研究國外報(bào)道較多，我國的報(bào)道主要集中在浙江、上海、廣東等地區(qū)，關(guān)于iceA、babA的研究逐步成為熱點(diǎn)。甘肅河西走廊地區(qū)(蘭州、張掖、金昌、武威)是我國胃癌高發(fā)地區(qū)，該地區(qū)上消化道疾病患者中Hp的檢出率高達(dá)81.3%[6]。本研究旨在探討甘肅河西走廊地域流行Hp 基因iceA、babA的基因多樣性及在不同疾病患者中的分布狀況，以期探明河西走廊地區(qū)Hp iceA、babA的流行特點(diǎn)，并為該地區(qū)Hp感染相關(guān)疾病的預(yù)療提供必要的研究支持。

從概念的應(yīng)用看，第一學(xué)段主要在于做有關(guān)平行四邊形的拼圖，第二學(xué)段多運(yùn)用平行四邊形的文字定義，與長方形、正方形等圖形建立聯(lián)系，有一定的抽象和推理要求，第三學(xué)段則將定義應(yīng)用于嚴(yán)格的演繹推理．

1 資料與方法

1.1一般資料 Hp菌株于2016年1月至2018年1月采自甘肅省第二人民醫(yī)院(蘭州市)(16株)、張掖市人民醫(yī)院(19株)、武威市腫瘤醫(yī)院(17株)及金川公司職工醫(yī)院(21株)的82例胃鏡檢查患者的胃黏膜，共分離73株Hp，以上臨床分離的Hp菌株及Hp ATCC26695均已為實(shí)驗(yàn)室保存。患者入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)胃鏡診斷疾病(胃部炎癥、消化性潰瘍及胃部腫瘤)；(2) 患者年齡20～70歲；(3)患者取標(biāo)本前2周內(nèi)未服用抗生素。分離胃黏膜均獲得上述患者同意，所有患者的臨床診斷均為病理及胃鏡明確診斷。最終選取診斷病例為淺表性胃炎24例、萎縮性胃炎23例、消化性潰瘍17例、胃癌9例，并記錄患者的臨床信息。

2.2不同病理類型的患者中Hp iceA、babA2基因型的分布情況 在Hp感染的上消化道疾病患者中，淺表性胃炎、萎縮性胃炎、消化性潰瘍患者體內(nèi)的Hp 以iceA1基因型為主(P<0.05)，胃癌患者體內(nèi)Hp 以iceA2基因型為主(P<0.05)；消化性潰瘍、胃癌患者體內(nèi)Hp babA2基因型比例明顯高于淺表性胃炎、萎縮性胃炎患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。73株Hp在不同病理類型患者中的分布情況，見表3。

1.2.3Hp分離培養(yǎng)及鑒定 將胃黏膜均勻涂抹在制備的Hp培養(yǎng)基上，于Hp培養(yǎng)盒37 ℃微需氧條件下(85%N2、10%CO2、5%O2)培養(yǎng)3～5 d；培養(yǎng)后觀察菌落形態(tài)、生化反應(yīng)(氧化酶、觸酶、尿素酶)以及革蘭染色涂片確認(rèn)Hp菌株，并將其于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2Hp培養(yǎng)基配置 哥倫比亞瓊脂中按比例加入選擇劑(萬古霉素10 mg/L、兩性霉素B10 mg/L、多粘菌素 2 500 U/L、甲氧芐啶5 mg/L)、10%葡萄糖及7%新鮮脫纖維蛋白羊血制成Hp培養(yǎng)基。

1.2.1試劑及儀器 哥倫比亞瓊脂粉購自美國BD公司，脫纖維蛋白羊血購自甘肅省人民醫(yī)院，Hp選擇劑中兩性霉素B購自北京索萊寶，萬古霉素購自美國Sigma公司，甲氧芐啶購自加拿大BBI公司；Hp培養(yǎng)盒、微需氧產(chǎn)氣袋購自日本三菱公司。Hp驗(yàn)證試劑中氧化酶試紙、觸酶試劑購自蘭州耐滴生物公司，尿素酶試劑購自福建三強(qiáng)公司；核酸提取試劑盒、引物、PCR反應(yīng)試劑盒、瓊脂糖購自美國HydraGene公司，電泳Marker DL2000購自大連寶生物TaKaRa公司，EB購自上海生工公司，-80 ℃冰箱購自美國Thermo公司，純水儀、超凈臺(tái)、生物安全柜購自香港Heal force公司，滅菌高壓鍋購自上海三申公司，恒溫溫箱購自美國Thermo公司，顯微鏡購自日本奧林巴斯公司，低溫高速離心機(jī)購自美國Thermo公司，PCR儀購自美國ABI公司，電泳儀購自北京六一儀器廠，全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)購自上海嘉鵬科技公司。

1.2方法

1.2.5Hp引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增 Hp iceA、babA2分型基因引物序列和擴(kuò)增條件參照文獻(xiàn)[7]。引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中10×Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，Primer 2 μL，Hp模版1 μL， Taq DNA 1 μL，加ddH2O至25 μL。擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性30 s，iceA 55 ℃退火1 min(babA 57 ℃退火1 min)，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次，72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束后將擴(kuò)增產(chǎn)物置于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察。以Hp 26695為陽性對(duì)照菌株，ddH2O為陰性對(duì)照。

2.1河西走廊地區(qū)Hp菌株iceA、babA2基因型在患者中的分布 河西走廊地區(qū)iceA、babA2基因型檢測(cè)結(jié)果顯示，73株Hp iceA基因擴(kuò)增均為陽性，其中iceA1型56株(76.71%)，iceA2型17株(23.29%)；babA2基因型28株(38.36%)。20～<41、41～<61歲年齡組患者中，Hp iceA1型感染率均明顯高于iceA2型(P<0.05)；61～70歲患者中Hp iceA2型感染率明顯高于61歲以下各年齡段人群(P<0.05)。不同性別患者iceA基因型及Hp babA2基因型比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Hp iceA、babA2基因型在患者中的分布，見表2。Hp iceA1、Hp iceA2基因型電泳結(jié)果見圖1、2。

1.2.4Hp模版DNA制備 復(fù)蘇保存的73株Hp菌株及標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC26695，于磷酸鹽緩沖液(PBS)中沖洗2次，經(jīng)核酸提取試劑盒提取Hp核酸DNA，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 Hp iceA、babA2引物序列

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

[9][40][43][45][47][53][54][55][56] 劉修巖、李松林、秦蒙：《城市空間結(jié)構(gòu)與地區(qū)經(jīng)濟(jì)效率——兼論中國城鎮(zhèn)化發(fā)展道路的模式選擇》，《管理世界》2017年第1期，第51-64頁。

圖1 iceA1基因型PCR電泳結(jié)果

圖2 babA2基因型PCR電泳結(jié)果

表2 Hp iceA、babA2基因型在患者中的分布[n(%)]

a：P<0.01，b：P<0.05，與61～70歲比較

③鉑鉻合金支架：波士頓科學(xué)（Promus支架），說明書指出支架植入術(shù)后可立即性核磁共振檢查，但建議靜態(tài)磁場(chǎng)強(qiáng)度3T或以下；最大全身平均比吸收率為2.0W/Kg或更低；掃描可持續(xù)15 min；靜態(tài)磁場(chǎng)梯度＜14 T/m。

研究獲取的POI數(shù)據(jù)是現(xiàn)實(shí)空間地理實(shí)體的抽象，所以原始數(shù)據(jù)并沒有考慮實(shí)體對(duì)象的規(guī)模，比如高等院校和鞋帽皮具店之間的規(guī)?？赡芫陀泻艽蟛町?，如果一個(gè)地區(qū)這兩種類型POI點(diǎn)的數(shù)量相等，忽略它們規(guī)模上的差異就計(jì)入統(tǒng)計(jì)結(jié)果，就會(huì)對(duì)識(shí)別功能區(qū)產(chǎn)生一定的影響。因此考慮不同類型POI數(shù)據(jù)的規(guī)模并對(duì)原始POI數(shù)據(jù)類型進(jìn)行重新整理后，得到新的POI數(shù)據(jù)分類表（表1）。

表3 不同病理類型患者中Hp iceA、babA2基因型分布狀況

a：P<0.01，b：P<0.05，與胃癌比較；c：P<0.05，與消化性潰瘍比較

3 討 論

自WARREN等[8]于1983年從人體胃黏膜中成功分離出Hp以來，世界范圍內(nèi)便開啟了關(guān)于Hp研究的序幕。在胃腸道疾病的眾多致病因素中，現(xiàn)已確認(rèn)Hp為重要致病因素[3]。Hp主要通過其毒力因子致病，vacA、cagA等毒力因子于前些年得到廣泛的關(guān)注[3]，而關(guān)于Hp毒力因子iceA和babA的研究則相對(duì)較少，近年來iceA和babA也逐漸成為研究熱點(diǎn)[9]。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Hp iceA與乳酸奈瑟菌限制內(nèi)切酶具有一定的同源性[10]；又有ABU-TALEB等[11]發(fā)現(xiàn)大部分Hp菌株iceA1并不是編碼功能蛋白，而是在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)其下游HpyIM基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)主要通過DNA甲基化水平的改變來調(diào)控相關(guān)毒力的表達(dá)，從而對(duì)Hp的致病作用有著間接調(diào)節(jié)的影響。YAKOOB等[12]研究發(fā)現(xiàn)，iceA是獨(dú)立于vacA、cagA的毒力因素，其與消化性潰瘍和白細(xì)胞介素8(IL-8)介導(dǎo)的黏膜厚度改變有關(guān)聯(lián)。而iceA的基因多樣性具有明顯的地域差異，美洲、歐洲國家分離的Hp菌株iceA基因型主要以iceA2型為主[10]，南歐地區(qū)iceA2型檢出率為66.2%[13]。FELICIANO等[14]研究發(fā)現(xiàn)，南美古巴地區(qū)Hp iceA2型的檢出率為57.3%；而在亞洲iceA分型則以iceA1型為主。KABAMBA等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在韓國、日本分離出的Hp以iceA1型為主要基因型。我國上海iceA1型檢出率為74.5%[5]、西安iceA1型的檢出率為76.1%[10]，這與本研究中iceA1型檢出率為76.71%相似。但內(nèi)蒙古地區(qū)有報(bào)道顯示iceA1型的檢出率則為53.04%[16]，存在一定的差異性，這可能與采樣的人群結(jié)構(gòu)有關(guān)，結(jié)果還需進(jìn)一步論證。本研究中20～<41、41～<61歲的患者及淺表性胃炎、萎縮性胃炎、消化性潰瘍等病理類型組的Hp iceA基因型均以iceA1型為主，這和上述研究結(jié)果基本保持一致[13-16]。胃癌患者Hp主要以iceA2型為主，這也與國外部分研究結(jié)論相一致，但由于本研究中納入的胃癌組標(biāo)本量比較少，還需要繼續(xù)增大標(biāo)本量才能做出明確的研究論斷。

Hp babA基因編碼的蛋白質(zhì)相對(duì)分子量約為78×103，babA基因有babA1、babA2兩型基因， babA2較babA1在信號(hào)肽區(qū)多一個(gè)10 bp堿基的插入序列從而能夠形成起始密碼子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，故只有babA2類型具有活性[17]。本研究中babA2的檢出率為38.36%，各年齡段組、性別組人群中分布大致相同，而消化性潰瘍、胃癌組babA2的檢出率明顯高于淺表性胃炎、萎縮性胃炎患者(P<0.05)，這一結(jié)果與伊朗[18]及上海[5]等地研究結(jié)果基本一致，但是與西安[19]報(bào)道的研究結(jié)果存在差異。這進(jìn)一步證明了患者感染是Hp分布的多樣性、致病機(jī)制的復(fù)雜性及環(huán)境和宿主關(guān)聯(lián)性的綜合結(jié)果，需要與Hp相關(guān)的研究的進(jìn)一步延伸討論。

河西走廊作為我國通往西方的“古絲綢之路”的重要部分，研究該地區(qū)Hp iceA、babA2基因的分布對(duì)探索東、西兩方Hp菌株的遺傳多樣性和上消化道感染疾病的致病機(jī)制有著非凡的意義?，F(xiàn)已有研究發(fā)現(xiàn)，河西走廊地區(qū)上消化道疾病中胃癌高發(fā)，且病例中存在較高的Hp感染率[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，河西走廊地區(qū)流行的Hp菌株中iceA基因均為陽性，并且以iceA1型為主，Hp iceA基因型分布與患者的疾病類型及患者年齡有關(guān)，但與患者性別無明顯關(guān)聯(lián)性；河西走廊地區(qū)流行的Hp菌株babA2基因型感染較多發(fā)生于消化性潰瘍、胃癌患者，并同其他地區(qū)相關(guān)研究一致。

福建省在國家防辦制定的實(shí)施方案編制大綱基礎(chǔ)上，制定了福建省建設(shè)實(shí)施方案編制大綱，監(jiān)測(cè)預(yù)警系統(tǒng)建設(shè)技術(shù)要求，防御宣傳手冊(cè)、宣傳欄、警示牌樣式和防御預(yù)案編制要求和范本等。這些技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)明確了“構(gòu)建監(jiān)測(cè)預(yù)警網(wǎng)絡(luò)和群測(cè)群防的防御體系，完善‘預(yù)警到鄉(xiāng)、預(yù)案到村、責(zé)任到人’工作機(jī)制，實(shí)現(xiàn)有效防御山洪災(zāi)害，保障人民群眾生命安全，最大限度減輕山洪災(zāi)害損失”的建設(shè)目標(biāo)；規(guī)范了建設(shè)任務(wù)、建設(shè)內(nèi)容和概算編制要求等；體現(xiàn)了具有福建特色的項(xiàng)目總體要求和技術(shù)方案，為各地編制實(shí)施方案奠定了良好基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究為河西走廊地區(qū)Hp遺傳多樣性、疾病預(yù)防控制的研究提供了相對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)，可為 Hp iceA、babA2基因與患者感染的致病關(guān)系、疾病發(fā)展及轉(zhuǎn)化機(jī)制等提供進(jìn)一步深入研究、探討的方向。