任風鳴，白 娟，劉 艷，曹厚強，王慶國，李生強

（1.重慶市藥物種植研究所 重慶 408435；2.重慶市中藥良種選育與評價工程技術(shù)中心重慶 408435；3.重慶市渝北區(qū)經(jīng)濟作物技術(shù)推廣站 重慶 401120；4.重慶市渝北區(qū)洛磧鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心 重慶 401137；5.重慶市渝北區(qū)興隆鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心 重慶 401137）

白及Bletilla striata(Thunb ex A.murray)Rchb.f.是蘭科白及屬植物[1]，為《中國藥典》2015版一部收載"白及"藥材的植物來源[2]，具有收斂止血、消腫生肌的功效[2]。其提取物“白及膠”是優(yōu)良的生物高分子材料、藥用輔料和日化品原料，性能卓越、用途廣泛[3-4]。一直以來，白及依賴野生品供給，上世紀90年代后，市場需求量激增，掠奪式的采挖導(dǎo)致野生資源幾近枯竭，被列入《中國珍稀瀕危植物名錄》[5,6]。為緩解市場供需矛盾和對白及資源進行有效保護，近年來大力開展人工種植。但目前，白及野生變家種仍處于起步階段，人工種植多采用野生種源作種，種質(zhì)混雜、優(yōu)良品種缺乏，影響藥材產(chǎn)量和質(zhì)量。急需開展白及種質(zhì)資源研究，鑒定和發(fā)掘優(yōu)良種質(zhì)，培育優(yōu)良品種，為人工種植發(fā)展提供支撐。

DNA 分子標記技術(shù)是藥用植物種質(zhì)資源研究即遺傳多樣性分析的重要手段。常用的DNA分子標記技術(shù)主要有基于分子雜交（如RFLP等）和基于PCR技術(shù)（如RAPD、ALFP、SSR、ISSR、SNP、SRAP 等）兩大類[7,8]。以分子雜交為核心的分子標記技術(shù)（如RFLP），由于操作過程繁瑣、耗時長，應(yīng)用越來越少[9]。基于PCR技術(shù)的分子標記各具特點，但均具有一定局限性。如RAPD 標記操作雖簡便，但為顯性標記，不能鑒別雜合子和純合子；SSR 擴增得到的多為共顯性標記，但其引物開發(fā)費時且成本較高；AFLP 以其精確、可靠被廣泛應(yīng)用，但其操作步驟復(fù)雜、對樣品質(zhì)量要求高、成本昂貴[7-10]。SRAP操作簡便、引物設(shè)計相對簡單、多態(tài)性豐富等特點，但由于是對ORFS進行擴增，對基因組部分區(qū)域的覆蓋度低（如著絲粒附近和端粒）[8]。目前，還沒有一種理想的、通用的分子標記技術(shù)[8]，往往需要根據(jù)物種、實驗材料以及實驗條件的不同選擇適宜的分析技術(shù)，或開發(fā)新的更加有效的分子標記。

DNA條形碼利用標準的、較短的DNA序列對物種進行快速、準確鑒定和親緣關(guān)系分析[11-13]。由于是采用通用引物擴增短片段，并將擴增序列測序用于分析，與大多數(shù)分子標記技術(shù)比較，具有操作簡單、快速，樣品質(zhì)量要求較低，準確度高、重復(fù)性好等優(yōu)勢。吳波等[14]采用ITS2 對不同產(chǎn)地桔梗遺傳多樣性進行了研究，結(jié)果表明，桔梗種內(nèi)遺傳變異程度大，親緣關(guān)系與地理位置顯著相關(guān)，ITS2序列適用于桔梗種內(nèi)遺傳多樣性研究。Zhang 等[15]采用nrDNA NADPH 序列，cpDNA trnH-psbA和trnG序列對瀕危藥用植物毛黃堇遺傳多樣性進行了分析，有效評估了其在不同分布區(qū)的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)。這些研究為DNA 條形碼在中藥材遺傳多樣性研究中的應(yīng)用提供了參考。本研究采用ITS 序列對不同產(chǎn)地白及遺傳多樣性進行分析，以揭示其種質(zhì)資源遺傳背景，為白及優(yōu)良品種選育和資源保護提供依據(jù)，同時為DNA條形碼在藥用植物遺傳多樣性研究中的應(yīng)用積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗樣本共35 個（不同產(chǎn)地白及22 個，黃花白及9 個，小白及4 個），其中11 個為新采集，24 個來自GenBank。實驗樣本分別來自中國（安徽、重慶、浙江、江西、湖南、陜西）、美國、韓國等，樣品信息見表1。新采集樣品經(jīng)重慶市藥物種植研究所劉正宇研究員鑒定，憑證標本保存于重慶市藥物種植研究所標本室。采集新鮮、幼嫩的白及植株葉片，硅膠迅速干燥，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取、PCR擴增及測序。

取樣品材料約30 mg，DNA 提取研磨儀（Retsch MM400，Germany）研磨2 min（30次·秒-1），采用植物基因組DNA 提取試劑盒（Tiangen Biotech Co.,China）提取總DNA。ITS序列PCR擴增采用25 μL反應(yīng)體系，包括模板DNA 約50 ng、2×Taq PCR MasterMix（Aidlab Biotechnologies Co.,China）12.5 μL、2.5 μmol引物各1 μL（Sangon Co.,China），ddH2O 補足至25 μL。PCR 擴增引物、反應(yīng)條件和擴增程序均參考文獻[13]。PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后，送華大基因公司采用ABI 3730XL（Applied Bio-systems Co.,USA）測序儀進行雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

測序峰圖采用Condon Code Aligner V 5.1.5（Condon Code Co.,）軟件進行校對拼接，獲得ITS 序列。采用Clustal W（Version 2.1）軟件進行序列比對。應(yīng)用MEGA6.06 軟件分析SNP 位點，基于Kimura 2-parameter（K2P）模型分析種內(nèi)、種間、產(chǎn)地內(nèi)、產(chǎn)地間遺傳距離，鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列特征

實驗樣品PCR 擴增和測序成功率皆為100%，35個樣本ITS 序列基因型、長度、GC 含量、變異位點、信息位點數(shù)等統(tǒng)計結(jié)果見表2。22 份不同產(chǎn)地白及ITS序列具有16 個基因型，4 個堿基的長度變異。與同屬近緣種比較，白及ITS序列基因型多樣性、序列長度顯著低于黃花白及和小白及。

2.2 遺傳距離分析

白及種內(nèi)遺傳距離在0-0.0337 間，種內(nèi)平均遺傳距離為0.0163。產(chǎn)地內(nèi)（1 個省級行政區(qū)視為1 個產(chǎn)地）遺傳變異在0-0.007 7間，產(chǎn)地間遺傳變異在0.001 6-0.030 1 間。產(chǎn)地內(nèi)平均遺傳距離（0.003 3）顯著低于產(chǎn)地間平均遺傳距離（0.016 9），表明不同產(chǎn)地白及親緣關(guān)系與地理分布具有一定相關(guān)性，地理分布越近，往往遺傳距離越小，親緣關(guān)系越近。產(chǎn)地內(nèi)最大遺傳距離（0.007 7）大于產(chǎn)地間最小遺傳距離（0.001 6），因此，通過ITS 序列不能嚴格地將不同產(chǎn)地白及樣品區(qū)分開。白及近緣種黃花白及產(chǎn)地內(nèi)平均遺傳距離（0.007 8）顯著低于產(chǎn)地間平均遺傳距離（0.050 1），表明黃花白及親緣關(guān)系與地理分布具有相關(guān)性。而其產(chǎn)地內(nèi)最大遺傳距離（0.012 4）小于產(chǎn)地間最小遺傳距離（0.017 7），通過ITS 序列能將不同產(chǎn)地的黃花白及樣品區(qū)分開。

2.3 親緣關(guān)系聚類分析

聚類分析顯示，22 個不同產(chǎn)地白及樣品聚為3 個主要的分支，如圖1。來自重慶的樣品與來自韓國的兩個樣品聚為一支。來自江西的樣品與1個來自湖南湘潭的樣品聚為一支。來至安徽的樣品聚為一支。此外，來至美國和英國的樣品分別單獨聚為1 支?？傮w上來自同一產(chǎn)地的樣品傾向于聚為1 支，如安徽、江西、重慶的樣品各自聚為1 支。來自相鄰產(chǎn)地的樣品傾向于聚在一起，如江西與湖南的樣品，浙江與江西、安徽的樣品。因此，聚類分析結(jié)果表明，不同產(chǎn)地白及親緣關(guān)系與地理分布具有一定相關(guān)性，地理分布越近，親緣關(guān)系往往越近。

表1 樣品信息

表2 白及及其近緣種序列特征及遺傳距離

圖1 22個不同產(chǎn)地白及親緣關(guān)系NJ樹

2.4 變異位點分析

種內(nèi)和種間變異位點在物種鑒定、種質(zhì)鑒定和特殊遺傳資源的發(fā)掘和利用等方面具有重要價值。22不同產(chǎn)地白及在613個堿基比對長度內(nèi)含有44個變異位點，其中有效信息位點18 個，變異位點信息見表2、圖2。來自安徽的樣品分別在第321、350、410 個堿基處具有穩(wěn)定的單堿基變異，區(qū)別于其它所有產(chǎn)地的樣品，可作為安徽產(chǎn)地白及的特征性識別位點。此外，來自浙江的樣品在129、154、188、451、454 處有5 個單堿基突變，在432、433、434處有3個堿基的連續(xù)突變。由于浙江的樣本數(shù)有限，是否這些突變?yōu)榉€(wěn)定的變異位點，還待進一步的實驗論證。

3 討論

3.1 基于ITS序列的白及遺傳多樣性

白及在我國分布較廣，四川、重慶、貴州、云南、湖南、湖北、安徽、江西、浙江、陜西、甘肅等地皆有分布[16]。本研究顯示，白及種內(nèi)遺傳距離為0-0.033 7（0.016 3），種間平均遺傳距離為0.031 1-0.044 1（0.037 1），種間平均遺傳距離大于白及種內(nèi)平均遺傳距離。吳勁松等[17]采用ITS序列對白及屬物種鑒定研究顯示，其種內(nèi)遺傳距離為0-0.012（0.006），種間平均遺傳距離為0.022-0.106（0.045），種間平均遺傳距離大于種內(nèi)平均遺傳距離，與本研究結(jié)果一致。但其種內(nèi)遺傳距離遠小于本研究，這可能與本研究中白及采用的樣本量（22個）更大有關(guān)。Yuan等[18]研究表明，當歸屬23個種ITS種內(nèi)平均遺傳距離為0-0.002（0.000 1），種間遺傳距離為0-0.113（0.004 7）；Yan等[19]研究表明，杜鵑花屬種內(nèi)平均遺傳距離為0-0.008 4（0.000 7），種間遺傳距離為0-0.421（0.149）；侯典云等[20]研究顯示，花椒種內(nèi)遺傳距離為0-0.003（0.001），種間遺傳距離為0.013-0.098（0.067）。由此可見，白及種內(nèi)遺傳變異較大，具有較為豐富的遺傳多樣性，白及屬物種間亦具有較大的遺傳變異，表明ITS 適用于白及遺傳多樣性分析。白及豐富的遺傳多樣性，可能由于其人工栽培發(fā)展較晚，種質(zhì)還未經(jīng)受人工定向選擇。同時，這些遺傳變異為白及優(yōu)良品種選育提供了豐富的種質(zhì)材料，需要進一步的措施有效保護和充分利用這一基因資源。

圖2 不同產(chǎn)地白及變異位點

3.2 白及親緣關(guān)系與地理分布的相關(guān)性及其在道地性鑒定中的意義

道地藥材是人們長期醫(yī)療實踐證明質(zhì)量好、療效佳，來源于特定產(chǎn)地的名優(yōu)正品藥材[21-23]，是優(yōu)質(zhì)中藥材的代名詞，是一個品質(zhì)概念。藥材道地性的的鑒定一直是一大難題。中藥材傳統(tǒng)四大鑒定方法：基原鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定和理化鑒定是品種真?zhèn)舞b別的經(jīng)典方法,而對于藥材品質(zhì)優(yōu)劣評價特別是道地與非道地藥材的鑒別,這四種鑒定手段往往效果欠佳[21]。遺傳變異、環(huán)境飾變、人文作用是道地藥材形成的“三大動力”[21]。遺傳特性、特定的生態(tài)環(huán)境、栽培與加工技術(shù)及中醫(yī)實踐等因素綜合作用形成道地藥材的獨特品質(zhì)[21,22]，道地產(chǎn)區(qū)的藥材往往具有獨特的遺傳基因及化學組成，可作為道地藥材鑒定的突破口，而DNA 分子標記從遺傳特性角度為道地藥材鑒定提供了一個重要手段。

基于ITS 序列的遺傳距離與親緣關(guān)系分析顯示，白及產(chǎn)地間平均遺傳距離大于產(chǎn)地內(nèi)遺傳距離。地理分布越近，遺傳距離越小，親緣關(guān)系越近，親緣關(guān)系與產(chǎn)地（地理分布）具有一定相關(guān)性。聚類分析顯示，來自同一產(chǎn)地（安徽、江西、重慶）或相鄰產(chǎn)地（湖南和江西）的樣品傾向于聚為一支，地理分布越近，在聚類樹上位置越近，同樣表明白及親緣關(guān)系與地理分布具有相關(guān)性。變異位點分析顯示，安徽產(chǎn)白及和浙江產(chǎn)白及都有特異性的變異位點，通過這些變異位點可以將皖產(chǎn)、浙產(chǎn)白及與其它產(chǎn)區(qū)的白及區(qū)分開。道地藥材來源于某一或幾個特定產(chǎn)地。貴州、四川、安徽是白及的傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)[16]，品質(zhì)較佳，雖未形成公認的道地產(chǎn)區(qū)，但在市場上具有一定影響力。本研究表明，基于ITS序列的白及遺傳關(guān)系與地理分布（及產(chǎn)地）具有相關(guān)性，同一產(chǎn)地的白及遺傳背景相對一致而與其它產(chǎn)地相區(qū)別，尤其安徽產(chǎn)和浙江產(chǎn)白及具有特異的變異位點，這些遺傳特性在白及道地性鑒定中具有較大應(yīng)用價值。

3.3 DNA 條形碼在藥用植物遺傳多樣性研究中的應(yīng)用潛力

傳統(tǒng)DNA 分子標記技術(shù)在中藥材遺傳多樣性分析[24]、遺傳作圖[25]、物種鑒定[7]及道地性鑒定[26-28]等方面廣泛應(yīng)用，并積累了豐富的研究資料。DNA條形碼作為一種新型的遺傳標記，已成為目前物種鑒定的重要工具[18]，同時，也在中藥材遺傳多樣性研究中探索應(yīng)用。吳波等[14]采用ITS2對不同產(chǎn)地桔梗遺傳多樣性研究表明，桔梗種內(nèi)遺傳變異程度大，與其地理位置顯著相關(guān)，ITS2序列適用于桔梗種內(nèi)遺傳多樣性研究。該研究為DNA 條形碼在中藥材遺傳多樣性及道地性鑒定研究中的應(yīng)用提供了參考。Zhang 等[15]采用核基因NADPH序列和葉綠體基因trnH-psbA和trnG序列有效的評估了瀕危藥用植物毛黃堇在不同分布區(qū)的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)。謝麗霞等[29]采用matK 與ITS1序列對34個不同產(chǎn)地麻黃的研究表明，麻黃種間具有較為豐富的遺傳多樣性，ITS1序列遺傳多樣性顯著高于matK序列。魏寶陽[23]采用ITS序列對吳茱萸藥材遺傳背景分析表明，序列差異主要存在于品種間，道地產(chǎn)區(qū)與非道地產(chǎn)區(qū)的遺傳差異較小。這些研究表明DNA條形碼可以用于藥用植物屬下種間或種下品種間的遺傳多樣性分析，尤其適用于近緣物種間遺傳多樣性的比較，如狄紅艷等[30]基于ITS和trnL-trnF序列對草木樨遺傳多樣性研究表明，黃花草木樨遺傳多樣性高于白花草木樨。DNA 條形碼是基于序列分析的遺傳標記技術(shù)。采用通用引物擴增短片段DNA序列，對樣品質(zhì)量要求較低，操作簡單、快速，且重復(fù)性好；目的序列通過測序后用于遺傳分析，準確度高、可靠性強，具有大多數(shù)分子標記技術(shù)無法比擬的優(yōu)勢。隨著DNA 條形碼在藥用植物物種鑒定中的大量應(yīng)用，DNA條形碼數(shù)據(jù)庫不斷補充和完善，會積累海量的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，將進一步推動DAN 條形碼在藥用植物遺傳多樣性研究中的應(yīng)用。