王書菁，施曉峰，廖寧波，吳康軍，周文婕，盧宇劍，程東慶＊＊

（1.浙江中醫(yī)藥大學醫(yī)學技術學院 杭州 310053；2.浙江省疾病預防控制中心 杭州 310051）

諾如病毒（Norovirus,NoV）屬于杯狀病毒科（Caliciviruses）的諾瓦克病毒屬，諾如病毒感染性極強，是引起人類急性胃腸炎的最常見病原微生物之一[1]。中國自1995年報告首例諾如病毒感染病例后，國內許多地區(qū)多次暴發(fā)諾如病毒感染性急性胃腸炎案例[2]。2016 年10 月17 號，哈爾濱醫(yī)科大學接到43 名學生反應消化系統(tǒng)不適，出現(xiàn)嘔吐、發(fā)熱、腹瀉的癥狀，事后確診39 名為諾如病毒感染＊＊＊中新網(wǎng).http：//news.jxntv.cn/2016/1017/8177862.shtml。2014 年1 月下旬，浙江嘉興市海寧、海鹽兩地部分學校出現(xiàn)聚集性學生惡心嘔吐腹瀉等癥狀，經當?shù)丶部刂行臋z測確定為諾如病毒感染＊＊＊＊人民網(wǎng).http：//politics.people.com.cn/n/2014/0220/c70731-24414205.html。目前諾如病毒尚未有疫苗面世，也沒有特異的抗病毒藥物[3]。諾如病毒已成為一個日益嚴重的公共衛(wèi)生問題。

資料顯示，G Ⅱ型諾如病毒（Genogroups ⅡNorovirus，GⅡ.NoV）是中國的流行優(yōu)勢株，一般通過糞-口傳播。糞-口傳播包括了食源性、水源性以及人-人直接接觸傳播[4]。食物中的諾如病毒滅活一般采用熱高壓即可滅活[5]，國內外針對諾如病毒的滅活研究主要是水體中的諾如病毒。在傳統(tǒng)水處理工藝中，國內外均采用總大腸菌群或大腸菌群作為評價水處理效果的指示微生物，水處理中病毒的安全問題未得到應有的重視[6]，而且水體很難做到完全清除病毒，因此開發(fā)和完善諾如病毒的檢測及滅活技術，對諾如病毒的預防控制將起到重要作用。

本實驗研究中藥提取物對諾如病毒的滅活效果，為減少諾如病毒污染、保障公共衛(wèi)生健康提供實驗支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品

諾如病毒陽性樣品：由浙江省疾病預防控制中心提供，樣品保存于-80℃?zhèn)溆茫?/p>

中藥材：魚腥草（Houttuynia cordata）購自興寧市長城醫(yī)藥有限公司泰安藥行，天然蜂膠原膠（Propolis）購于江蘇泰安市農家養(yǎng)蜂園。

1.2 實驗儀器

SKY-200B型恒溫培養(yǎng)搖床；MLS-3020CH型高壓蒸汽滅菌鍋；ABI 7500 熒光定量PCR 儀；1300 系列A2型生物安全柜；金屬??；紫外殺菌儀；W2010B 型數(shù)控恒溫水浴鍋；TC-15 恒溫電熱套；R-20J 旋轉蒸發(fā)儀；SHZ-D-III 型循環(huán)水真空泵；SHP 250 型生化培養(yǎng)箱；DHG 9420A 型電熱恒溫鼓風干燥箱；DR/2400 型便攜式分光光度計等。

1.3 實驗試劑

Qiagen RNeasy Mini Kit（74104，Qiagen）、QIAamp Viral RNA Mini Kit（52904，Qiagen）、One Step PrimescriptTMRT-PCR Kit（RR064A，Takara）、人諾如病毒抗原ELISA檢測試劑盒（18584，上海江萊生物技術有限公司）等。

1.4 實驗方法

1.4.1 中藥提取物的制備[7-10]

中藥材清洗干燥后打成粗粉用于提取。

水提法：稱取50 g的藥物粉末，加蒸餾水1 L，95℃提取4 h，過濾除渣，取濾液。濾渣中再加蒸餾水1 L，按上法再次抽提2 h后過濾除渣，取濾過液，合并兩次濾過液，旋轉蒸發(fā)儀濃縮干燥。

醇提法：稱取50 g 的藥物粉末，采用95%乙醇提取，按照1∶10的料液比，95℃提取4 h，過濾除渣，取濾液。濾渣中再加95%乙醇1 L，按上法再次抽提2 h 后過濾除渣，取濾過液，合并兩次濾過液，旋轉蒸發(fā)儀濃縮干燥。

1.4.2 RT-qPCR檢測病毒含量

采用QIAamp Viral RNA Mini Kit 提取樣品中的核酸為模板，用One Step PrimescriptTMRT-PCR Kit 試劑盒進行反應。引物和探針均由上海生工有限公司合成，引物[11,12]序列（表1）、反應體系（表2），42℃逆轉錄30 min 后95℃預變性2 min，變性5 s、55℃退火35 s 共40個循環(huán)。

表1 RT-qPCR引物和探針序列

表2 RT-qPCR反應體系

1.4.3 中藥提取物對諾如病毒滅活的量效、時效關系研究

量效關系研究：中藥提取物（濃度1、10、25、50 mg·mL-1）室溫下與100 μL 的病毒懸液孵育30 min，設立溶劑對照組（只加100 μL的DMSO和100 μL的病毒懸液）；空白對照組（加入100 μL 的無菌水和100 μL的病毒懸液），應用RT-qPCR 進行檢測，檢出Ct 值越大，滅活效果越明顯。

時效關系研究：中藥提取物（濃度50 mg·mL-1）室溫下與100 μL 的病毒懸液孵育一定時間（0、15、30、60、120 min），設立溶劑對照組（只加100 μL 的DMSO和100 μL的病毒懸液）；空白對照組（加入100 μL的無菌水和100 μL 的病毒懸液），應用RT-qPCR 進行檢測，檢出Ct值越大，滅活效果越明顯。

1.4.4 滅活機理一——對諾如病毒蛋白外殼的破壞作用研究

中藥提取物（濃度1、10、25、50 mg·mL-1）室溫下與100 μL的病毒懸液孵育30 min，設立溶劑對照組（只加100 μL的二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)和100 μL的病毒懸液）；空白對照組（加入100 μL的無菌水和100 μL 的病毒懸液），用ELISA 試劑盒檢測結構未被破壞的完整病毒蛋白，檢測OD值越低說明對病毒的破壞作用越好。以紫外輻射法9 000 μ W·cm-2作用30 min、二氧化氯以10 mg·mL-1的濃度作用30 min、5%雙氧水作用30 min作為對照。

1.4.5 滅活機理二——對諾如病毒核酸的破壞作用

病毒滅活處理方法同上，提取病毒核酸，逆轉錄PCR（RT-PCR）擴增GII.NoV 特異性片段,瓊脂糖凝膠電泳檢測各處理組核酸序列的完整性，擴增引物（表3）、擴增反應體系（表4），42℃逆轉錄30 min后，95℃預變性5 s、變性35 s、55℃退火共40個循環(huán)，擴增產物由上海生工生物公司測序，比較各組序列的完整性，考察對核酸的破壞作用。

表3 GII.NoV 特異性片段擴增所用引物

表4 GII.NoV 特異性片段擴增體系

1.4.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS24.0 統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s)表示。統(tǒng)計學方法采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01 為差異有顯著性意義。

2 結果及分析

2.1 中藥提取物對病毒滅活的量效關系

中藥提取物與GII.NoV 作用30 min，在0-50（mg·mL-1）劑量范圍內，與對照組相比，蜂膠醇提物和魚腥草水提物均對諾如病毒有一定滅活作用，且隨著濃度提高，效果越明顯。

2.2 中藥提取物滅活病毒的時效關系

以50 mg·mL-1的劑量與GII.NoV 作用0、15、30、60、120 min，隨著滅活時間的增加，病毒量不斷降低；30 min到1 h之間滅活達到最大效果，作用1-2 h之間，滅活效果增加不再明顯。

2.3 中藥提取物/紫外/二氧化氯/雙氧水方法滅活效果的比較

比較50 mg·mL-1蜂膠醇提物滅活30 min、50 mg·mL-1魚腥草水提物滅活30 min，輻射劑量9 000 μ W·cm-2紫外作用30 min，10 mg·mL-1二氧化氯作用30 min、5%雙氧水作用30 min（圖1），五種方法對水中GII.NoV 均有顯著滅活效果，10 mg·mL-1二氧化氯作用30 min 后可以滅活85.13%的GII.NoV，9000 μ W·cm-2的紫外作用30 min后滅活率達到96.7%、5%雙氧水作用30 min后滅活率達到81.09%；而蜂膠醇提物和魚腥草水提物作用30 min后可以滅活97.03%和97.88%的病毒，略高于其他滅活方法。

表5 中藥提取物對GII.NoV的滅活作用（±s，n=5）

表5 中藥提取物對GII.NoV的滅活作用（±s，n=5）

表6 中藥提取物作用時間對GII.NoV的滅活影響（±s，n=5）

表6 中藥提取物作用時間對GII.NoV的滅活影響（±s，n=5）

注：與對照組比較，P＜0.05

圖1 五種滅活方法對GII.NoV的滅活效果

2.4 五種滅活方法對諾如病毒蛋白外殼的破壞作用

蜂膠醇提物、魚腥草水提物、紫外線、二氧化氯和雙氧水處理諾如病毒后通過ELISA檢測結構未被破壞的完整病毒蛋白，其OD 值結果（表7）。與對照組相比，魚腥草水提物、紫外線、二氧化氯和雙氧水處理OD值均明顯下降，說明病毒外殼蛋白表面抗原受到了破壞，其中尤以二氧化氯和紫外效果最為明顯；但是蜂膠醇提物對諾如病毒顆粒的破壞作用不明顯。

表7 五種滅活方法處理后病毒液ELISA和RT-qPCR雙重檢測結果

圖2 幾種滅活方法處理前后的諾如病毒RT-PCR瓊脂凝膠電泳分析圖

表8 五種方法滅活處理后3對引物的擴增結果

圖3 ORF1的蛋白編碼位點

表9 消毒處理后諾如病毒ORF1核酸突變情況

2.5 5種滅活方法對諾如病毒核酸的破壞作用

5種方法滅活處理后，提取病毒核酸，擴增特異性片段，擴增結果（圖2，表8），魚腥草組和雙氧水組3個片段均未能擴增成功，蜂膠組、紫外組僅片段2擴增成功，二氧化氯組則成功擴出了第1、2片段。

RT-PCR 擴增產物經上海生工生物公司測序，利用DNAstar分析測序片段，為更好地觀察突變的程度，分別定義了保守點、突變點和高突變點，保守點堿基沒有發(fā)生變化，含有3 個堿基以內突變的為突變點，3 個以上堿基發(fā)生突變的為高突變點，分別計算突變率從而可以清楚地發(fā)現(xiàn)序列的變異情況。

圖2 和表8 可見ORF2 和ORF3（片段3）均未能擴增出，只有部分ORF1（片段1和片段2）能完整擴增出，因此筆者著重對ORF1 上的6 個蛋白區(qū)域進行詳細分析。ORF1 結構如圖3 所示，5’-N 端開始依次分別是p48、NTPase、p22、VPg、Pro及RdRp。

將有0-5 個堿基突變的定義為“+”，有5-10 個堿基突變的定義為“++”，將有10個以上堿基突變的定義為“+++”。5 種滅活方法處理后，ORF1 上各位點的突變情況（表9）。

3 討論

我國貝類產量已連續(xù)10多年名列世界第一，是我國水產品的重要組成部分。然而由于我國的水產品污染嚴重，檢測技術滯后，相關衛(wèi)生標準不能和國際接軌等種種因素，水產品出口屢次遭遇國際技術性貿易壁壘的限制，其中一項就是諾如病毒不得檢出。2004年5月，新加坡農業(yè)食品獸醫(yī)局(Agri-Food and Veterinary Authority of Singapore，AVA)從我國三批出口凍牡蠣檢出諾如病毒，貨物被退回。在此之前的2002 年，美國農業(yè)部用RT-PCR方法從進口中國文蛤中檢測出諾如病毒，導致中國出口到美國的文蛤受阻，使我國的貝類養(yǎng)殖業(yè)蒙受重大損失。

對貝類食源性病毒的滅活研究起步比較晚，研究的文章并不多，缺乏系統(tǒng)性。而諾如病毒對各種外界理化因素都有較強的抵抗力，在室溫條件下于pH 為2.7 的環(huán)境中暴露3 h 仍具有感染性[13]；酒精處理諾如病毒后，病毒無法被滅活[14]；在含3.75-6.25 mg·L-1氯的普通飲用水中，諾如病毒仍表現(xiàn)出一定的耐受性[15]；在10 mg·L-1高濃度氯離子（處理污水采用的氯離子）存在時才能被滅活[16]。諾如病毒對高溫、冰凍、高壓等也有一定的抵抗力：60℃作用30 min后，病毒不能完全滅活[17]；將含有諾如病毒的食品基質冰凍6個月后，其活性幾乎不受影響。

筆者選取蜂膠醇提物和魚腥草水提物對GII.NoV的滅活規(guī)律進行研究。在以0-50 mg·mL-1的中藥提取物作用30 min時，隨著濃度的增加，對諾如病毒的滅活效果越好。室溫下，蜂膠醇提物和魚腥草水提物以50 mg·mL-1為作用濃度，GII.NoV的減少率在30 min-1 h時達到最高，分別為1.16-1.77 log10和1.67-2.29 log10，表明中藥提取物對諾如病毒的滅活效率存在一定的時效性。蜂膠醇提物和魚腥草水提物作用30 min后可以滅活97.03 %和97.88 %的病毒，略高于其他滅活方法。在貝類收獲后，預先用含有上述提取物的溶液進行浸泡或者銷售運輸過程中的儲藏水里加入上述提取物，將有助于殺滅諾如病毒，有效地保障我國水產品衛(wèi)生安全，全面促進我國水產品經濟的持續(xù)發(fā)展。