王 宇，蔣嘉明，鄭 丹，譚紅勝，張 洪＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學中藥學院 上海 201203；2.中藥創(chuàng)新藥物研發(fā)上海高校工程研究中心 上海 201203）

補骨脂（Fructus Psoraleae，F(xiàn)P）為豆科植物補骨脂（Psoralea corylifoliaL.）干燥成熟果實，表面呈黑色、黑褐色或灰褐色，質(zhì)硬，有油性，氣香，味辛、微苦[1]。補骨脂化學成分較為復雜，主要包括香豆素，黃酮，單萜酚，苯并呋喃等化合物類型[2]。常作為補益類中藥，具有溫腎助陽，溫脾止瀉，納氣平喘的作用，其“補腎定心”的作用使其成為抗抑郁藥物的候選[3,4]。相關藥理學研究表明，補骨脂及其主要成分均具有抗抑郁的藥理作用[4-6]。然而，補骨脂可引起肝臟[7]、腎臟[8]及生殖毒性[9]，其臨床應用存在安全隱患[10]。近期毒理學研究報道表明，補骨脂的主要毒性成分為呋喃香豆素成分補骨脂素及異補骨脂素，可造成肝臟、腎臟及生殖系統(tǒng)損傷[11-13]。補骨脂酚可引起大鼠肝臟脂質(zhì)成分代謝異常，但無明顯的轉(zhuǎn)氨酶及器質(zhì)性改變[14]，所以補骨脂酚具有肝毒性風險，為潛在的毒性成分。因此，本研究得到補骨脂有效成分群（Effective componentsgroupof Fructus Psoraleae，EGFP），去除補骨脂主要毒性成分補骨脂素及異補骨脂素，保留主要抗抑郁活性成分黃酮類成分和補骨脂定，控制潛在毒性成分補骨脂酚的含量，并對該有效成分群進行抗抑郁藥效研究和安全性評價。

1 材料

1.1 受試藥物

補骨脂購買于上海上藥華宇藥業(yè)有限公司，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學中藥學院張紅梅副教授鑒定，確定為補骨脂Psoralea corylifoliaL.的干燥成熟果實。

鹽酸氟西汀分散片購買于禮來蘇州有限公司，批號7299AC；鹽酸文拉法辛緩釋膠囊購買于PfizerIrelandPharmaceuticals，批號R11422F。

圖1 實驗中所用對照品的HPLC色譜圖

1.2 動物

雌性ICR種小鼠，體重18-22 g，許可證號為SCXK（滬）2017-00005，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，飼養(yǎng)于恒溫、恒濕SPF 級動物實驗室內(nèi)，光照12 h，試驗期間自由飲水、飲食。試驗開始前適應性飼養(yǎng)7天，含1天檢疫期。

1.3 主要試劑

乙醇（上海潤捷化學試劑有限公司，批號20171101）；D101型大孔吸附樹脂（北京慧德易科技有限公司，批號170605）；聚酰胺樹脂（源葉生物有限公司，批號L25D8Q50895）；石油醚（上海潤捷化學試劑有限公司，批號20180130）；小鼠5 羥色胺（5-HT）ELISA試劑盒（上海心語生物科技有限公司，貨號XYU-00688）。

1.4 主要儀器

DigBehv動物行為學視頻分析系統(tǒng)（上海吉量軟件科技有限公司公司）；Plus384 型酶標儀（美國MolecularDevices 公司）；J91 金雀牌秒表（上海手表五廠）；BSA2202S電子天平（德國Sartorius公司）；7100血液生化分析儀（日本HITACHI 公司）；SCOPA1 顯微鏡（德國Zeiss公司）。

2 方法

2.1 EGFP的制備

將FP 藥材粉碎成粗粉，經(jīng)10 倍量70%乙醇加熱回流提取3次，每次2 h，濾過，合并濾液。樣品用D101型大孔吸附樹脂吸附，按1 g 樣品：6 g 樹脂的比例拌樣。先用8 BV的蒸餾水，以2 BV·h-1的流速洗脫，棄去洗脫液；再用5-6 BV的95%乙醇，以2 BV·h-1的流速洗脫，收集洗脫液。洗脫液用聚酰胺樹脂吸附，聚酰胺樹脂按200 目與100 目1∶2 比例混合。按1 g 樣品：6 g樹脂的比例拌樣。先用20 BV 的10%-15%乙醇，以2 BV·h-1的流速洗脫，棄去洗脫液；再用2-3 BV的95%乙醇，以2 BV·h-1的流速洗脫，收集洗脫液。聚酰胺95%乙醇洗脫液減壓回收乙醇至無醇味，加水混懸后用石油醚萃取，棄去上層石油醚部位，將水部位濃縮干燥得到EGFP，產(chǎn)率為10.2%。對主要成分進行定量分析，對照品如圖1所示。

2.2 EGFP小鼠抗抑郁藥效研究

2.2.1 動物分組及給藥劑量

120 只雌性小鼠隨機分為6 組，即陰性對照組、陽性對照組（氟西汀、文拉法辛）、EGFP 組（低、中、高劑量）；給藥劑量：陽性對照組給予20 mg·kg-1，EGFP分別給予15、30、60 mg·kg-1。給藥方法：口服灌胃，給藥體積10 ml·kg-1，連續(xù)7天，試驗期間自由飲水、進食。

圖2 EGFP的HPLC色譜圖

2.2.2 小鼠強迫游泳試驗

末次給藥后1 h，將小鼠單獨置于直徑20 cm，水深20 cm，水溫25℃的玻璃容器中，強迫游泳，燒杯周圍用黑色隔板隔開，保持試驗過程安靜，全程視頻記錄，記錄6 min內(nèi)后4 min小鼠的不動時間。

2.2.3 小鼠強迫懸尾試驗

末次給藥后1 h，將小鼠尾部距離尾尖部2 cm 處固定，使小鼠倒懸于支架上，頭部距離底部5 cm，周圍用黑色隔板隔開，保持試驗過程安靜，全程視頻記錄，記錄6 min內(nèi)后4 min小鼠的不動時間。

2.2.4 小鼠腦內(nèi)海馬組織及血清中5-HT含量檢測

上述強迫游泳試驗結(jié)束1 h 后，摘眼球取血，取海馬組織，稱重后加入10倍體積生理鹽水，勻漿，10 000 rpm離心15 min，取上清液；血液經(jīng)4 000 rpm 離心10 min，取血清，上述海馬組織離心后上清液及血清，采用ELISA法測定5-HT含量。

2.3 EGFP毒理學研究

2.3.1 急性毒性試驗

為盡量暴露EGFP 的急性毒性，給予能配置的最大濃度進行本次實驗。將20 只雌性ICR 小鼠隨機分為2 組，陰性對照小鼠給予配制溶劑，EGFP 組小鼠劑量為3.5 g·kg-1，口服灌胃，給藥體積10 ml·kg-1，2 次/天，給藥前禁食，2 次給藥間隔8 h。連續(xù)觀察小鼠14天，每隔7 天稱取體重，14 天后解剖檢測主要臟器，如見病理性改變，進行組織病理學檢查。

2.3.2 重復給藥試驗

本次實驗，EGFP 小鼠藥效學的有效劑量為60 mg·kg-1，選用5倍于有效劑量的給藥劑量300 mg·kg-1，進行56 天給藥實驗。本次小鼠重復給藥試驗為初步的毒性篩查，為大鼠的多次給藥毒性試驗的劑量設計提供參考。將20只雌性ICR小鼠隨機分為2組，陰性對照小鼠給予配制溶劑，EGFP組小鼠劑量為300 mg·kg-1，口服灌胃，給藥體積10 ml·kg-1，連續(xù)給藥56 天，每7天記錄體重變化，末次給藥24 h后眼眶取血進行生化檢測，取心、肝、脾、肺、腎等主要臟器進行組織病理學檢查，其中肝臟、腎臟稱取重量，計算臟器指數(shù)。

2.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件，計量資料采用“均數(shù)±標準差(±SD)”表示，兩組樣本比較采用T檢驗法分析，多組間比較采用單因素方差法，兩兩間比較方差齊性時用LSD 最小顯著性差異法析，方差不齊時用Dunnett's方法分析。

3 結(jié)果

3.1 EGFP主要成分含量

按2.1 制備方法制備得到EGFP，其不含已知的毒性成分補骨脂素和異補骨脂素，潛在毒性成分補骨脂酚的含量控制在3%以內(nèi)。其主要成分含量如下：補骨脂定4.98%，補骨脂二氫黃酮5.28%，補骨脂寧1.73%，補骨脂二氫黃酮甲醚7.98%，補骨脂酚2.35%（圖2）。

3.2 EGFP藥理學研究

3.2.1 EGFP對小鼠強迫游泳不動時間的影響

與陰性對照組比較，陽性對照組與EGFP 各劑量組均能顯著縮短小鼠的游泳不動時間（P＜0.05，P＜0.01），并呈現(xiàn)出劑量依賴性；與陽性對照文拉法辛比較，EGFP 高劑量組能顯著縮短游泳不動時間（P＜0.05）。結(jié)果顯示EGFP具有縮短小鼠強迫游泳試驗中不動時間的作用（表1）。

3.2.2 EGFP對小鼠強迫懸尾不動時間的影響

與陰性對照組比較，陽性對照組與EGFP 各劑量組均能顯著縮短小鼠的懸尾不動時間（P＜0.05，P＜0.01），并呈現(xiàn)出劑量依賴性；與陽性對照文拉法辛比較，EGFP 高劑量組能顯著縮短懸尾不動時間（P＜0.05）。結(jié)果提示EGFP具有縮短小鼠強迫懸尾試驗中不動時間的作用（表1）。

3.2.3 EGFP對腦內(nèi)海馬組織及血清中5-HT含量的影響

與陰性對照組比較，EGFP顯著提高高劑量組小鼠腦內(nèi)海馬組織及血清中的5-HT含量（P＜0.05）。結(jié)果表明EGFP 可顯著提高小鼠腦內(nèi)海馬及血清中5-HT的含量（表2）。

表1 EGFP對小鼠強迫游泳及懸尾不動時間的影響（±SD,n=10）

表1 EGFP對小鼠強迫游泳及懸尾不動時間的影響（±SD,n=10）

與陰性對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，與文拉法辛組比較，#P＜0.05。

表2 EGFP對小鼠腦內(nèi)海馬及血清5-HT的影響（±SD,n=10）

表2 EGFP對小鼠腦內(nèi)海馬及血清5-HT的影響（±SD,n=10）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05。

圖3 EGFP重復給藥56天對小鼠體重的影響

表3 EGFP重復給藥56天對小鼠肝臟腎臟指數(shù)的影響（±SD,n=10）

表3 EGFP重復給藥56天對小鼠肝臟腎臟指數(shù)的影響（±SD,n=10）

表4 EGFP重復給藥56天對小鼠生化指標的影響（±SD,n=10）

表4 EGFP重復給藥56天對小鼠生化指標的影響（±SD,n=10）

3.3 EGFP初步毒理學研究

3.3.1 急性毒性試驗

14 天觀察期內(nèi)EGFP 組小鼠未見明顯大體病變，組間體重無明顯差異，大體解剖未見體內(nèi)液體殘留，出血、變性等組織異常改變。

3.3.2 EGFP重復給藥56天對小鼠體重的影響

每日觀察受試小鼠狀態(tài)發(fā)現(xiàn)陰性對照組及EGFP組小鼠未見明顯異常，整個給藥周期陰性對照組及EGFP 組小鼠體重無明顯差異，均隨日期增長而增重（圖3）。

3.3.2 EGFP 重復給藥56 天對小鼠肝臟及腎臟重量的影響

陰性對照組及EGFP 組小鼠腎臟及肝臟指數(shù)無明顯差異（表3）。

3.3.3 EGFP重復給藥56天對小鼠血清生化指標的影響

生化指標中相關轉(zhuǎn)氨酶：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate aminotransferase，AST），總膽紅素（Total bilirubin,TBIL）未見明顯升高，肌酐(Creatinine，CREA)尿素UREA等指標亦與陰性對照組相比無顯著性差異（表4）。

3.3.4 EGFP重復給藥56天對小鼠組織病理學的影響

組織病理學檢查小鼠的心、肝、脾、肺、腎等主要臟器組織結(jié)構(gòu)完整，未見明顯的炎癥、壞死及變形等異常改變。上述對EGFP初步毒理學研究表明，EGFP對小鼠重復給藥56天無明顯毒性反應。

4 討論

抑郁癥（Depression）又稱抑郁障礙，以顯著而持久的心境低落為主要臨床特征，是心境障礙的主要類型[15]。臨床可見心境低落與其處境不相稱，情緒的消沉可以從悶悶不樂到悲痛欲絕，自卑抑郁，甚至出現(xiàn)自殺企圖或行為[16]。抑郁癥在美國的發(fā)病率為7%，女性多于男性，特別高發(fā)于15-44 歲的女性[17]。抗抑郁治療過程中，三環(huán)和單胺氧化酶抑制劑等為常用藥物，但整個治療周期較長，藥物不良反應（Adverse drug reactions，ADRs）發(fā)生率較高[18]。因此，抗抑郁臨床治療中，安全有效的天然藥物篩選具有重要意義。

本次試驗采用雌性ICR 小鼠進行測試EGFP 的抗抑郁藥理作用。另外，因補骨脂更易對雌性大鼠造成肝臟損傷[7]，故毒理學的初步研究亦使用雌性ICR小鼠進行。本研究表明，EGFP 可明顯縮短強迫游泳、懸尾小鼠不動時間（P＜0.05，P＜0.01），同時可升高腦內(nèi)海馬組織及血清中的5-HT 含量（P＜0.05），其機制可能為補骨脂直接調(diào)節(jié)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（corticotropin-releasing factor，CRF）基因轉(zhuǎn)錄，穩(wěn)定下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)HPA（Hypothalamic Pituitary Adrenal）系統(tǒng)，起到有效的抗抑郁作用[19]。急性毒性試驗表明，小鼠最大給藥量7 g·kg-1，為有效劑量的117倍，給藥后14 天觀察期內(nèi)未見明顯異常。EGFP 給予小鼠5倍有效劑量56天，亦未發(fā)現(xiàn)血清生化改變及主要臟器的毒性作用。

補骨脂抗抑郁有效成分群不含有主要毒性成分補骨脂素和異補骨脂素，潛在毒性成分補骨脂酚的含量控制在3%以內(nèi)，該有效成分群具有明顯的抗抑郁作用，同時有效降低補骨脂的毒性。本項研究保證補骨脂安全用藥，為盡早將其開發(fā)為安全、有效的中藥新藥提供科學依據(jù)。