趙月龍，閆若潛，王淑娟，馬震原，班付國，趙雪麗，謝彩華，楊朋霞

(1.河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，河南洛陽471003；2.河南省動物疫病預(yù)防控制中心，河南鄭州450008；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州450002)

豬塞尼卡病毒病是由A 型塞尼卡病毒(Senecavirus A，SVA)引起的一種豬水泡病。SVA 最早被稱作塞內(nèi)卡谷病毒A (Seneca Valley virus SVV)，2015 年國際病毒分類委員會(ICTV)將其列入小RNA 病毒科塞內(nèi)卡病毒屬，SVA 與同科的心肌炎病毒屬成員同源性最接近[1-2]。SVA 引起仔豬腹瀉，經(jīng)產(chǎn)母豬和公豬鼻、上顎、口腔、唇部和蹄冠周圍出現(xiàn)小泡和潰瘍，偶發(fā)腹瀉癥狀，1 日齡～3日齡的新生仔豬死亡率可達30 %～70 %[1-3]，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。迄今為止，美國、巴西、哥倫比亞、泰國等國家均報道發(fā)生過該病[3-6]。2015 年Wu 等報道在我國廣東省首次檢測出該病毒，并命名為CH-01-2015[7]。2016 年至今，我國湖北、河南、福建和黑龍江等省陸續(xù)發(fā)生SVA 疫情[8-11]。由于SVA 是國內(nèi)新出現(xiàn)的病毒，且目前國內(nèi)外對SVA 的認識及研究較少，一旦大規(guī)模暴發(fā)必定會給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部制定的《2018 年獸醫(yī)工作要點》 中明確提出要做好塞內(nèi)卡病毒病等新傳入疫病的防治工作，并且專門下發(fā)了《農(nóng)業(yè)農(nóng)村部辦公廳關(guān)于加強塞內(nèi)卡谷病毒防治的通知》。

由于SVA 感染豬以后引起的臨床癥狀與口蹄疫、豬水泡病和水泡性口炎等難以區(qū)分，僅憑借臨床癥狀和病理剖檢難以診斷豬塞卡病毒病。目前國內(nèi)外尚無檢測該病的商品化試劑盒。病毒分離鑒定是最常用的病原學(xué)檢測方法，但該方法操作繁雜，檢測周期長；PCR 及熒光定量PCR 檢測方法成本較高，儀器設(shè)備價格高昂，難以在基層推廣應(yīng)用；ELISA 方法具有操作簡便、敏感性高、適于大規(guī)模樣品檢測的優(yōu)點，是實驗室常用的檢測方法。目前國內(nèi)外均無SVA 的商品化疫苗使用，因此檢測血清抗體可以用于評價豬體的感染狀況；當(dāng)前國內(nèi)尚無商品化檢測該病毒的ELISA 方法和試劑可用[12]。

SVA 結(jié)構(gòu)蛋白VP1 和VP3 是主要的抗原表位區(qū)域，VP1 蛋白的抗原性強、相對保守[13]，可以刺激機體產(chǎn)生中和抗體，可以作為檢測SVA 抗體的指示抗原，為塞尼卡病毒病的診斷提供了方法[14]。因此，本研究重組表達了有活性的可溶性SVA-VP1(rVP1)蛋白并以其作為包被抗原建立了間接ELISA方法，為臨床上SVA 抗體檢測提供一種血清學(xué)檢測方法。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 SVA、BHK21 細胞、滅活SVA 免疫小鼠血清由河南省動物疫病預(yù)防控制中心實驗室保存并提供；FMDV (O/A/Asia I)陽性血清為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)的液相阻斷ELISA 檢測試劑盒中的陽性對照血清，PEDV、PCV2 陽性血清分別為加拿大Bio-Vet 公司、武漢科前生物股份有限公司生產(chǎn)的間接ELISA 試劑盒中陽性對照血清，PRRSV、PRV 陽性血清為美國愛德士(IDEXX)公司ELISA 試劑盒中的陽性對照血清，以上陽性血清共來自于5 個不同批次的試劑盒。50 份SVA 陰性豬血清采自臨床健康豬，經(jīng)PCR 和中和試驗檢測結(jié)果均為陰性；33 份SVA 滅活疫苗免疫的豬血清(SVA 陽性血清)由河南省動物疫病預(yù)防控制中心實驗室提供；205 份臨床豬血清來自河南省不同地區(qū)7 個規(guī)?；B(yǎng)豬場，由河南省動物疫病預(yù)防控制中心實驗室提供。

JM109、BL21 (DE3+)、DNA 凝膠純化試劑盒、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?、隨機反轉(zhuǎn)錄試劑盒、BCA Protein Assay Kit 均購自寶生物工程(大連)有限公司；T4 連接酶、限制性內(nèi)切酶、TaqDNA 聚合酶購自NEB 公司；IPTG 購自Sigma 公司；磁珠法全自動核酸提取試劑盒購自西安天隆科技有限公司；表達載體pET-32a(+)購自優(yōu)寶生物；His 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(可溶性蛋白)購自世紀(jì)康維生物科技有限公司；3,3',5,5'- 四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、western blot 試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗豬IgG-HRP 購自武漢三鷹生物科技有限公司；山羊抗鼠IgG-HRP購自Abcam 公司；分子量為25 ku 的蛋白質(zhì)超濾離心管為密理博(Millipore)產(chǎn)品。

1.2 引物設(shè)計與合成 參照GenBank 中登錄的SVA VP1 基因序列(KT321458.1)，利用Primer Premier6.0 軟件設(shè)計引物(5'-TACGGATCCGATTACACC CTCCGTCTCC-3'/5'-TACGAGCTCAGGGTTGGTCTC GATGTCG-3')，引物5' 端分別插入了保護性堿基和BamHⅠ、SaCⅠ兩個酶切位點(下劃線)，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.3 VP1 基因的擴增及重組表達載體的構(gòu)建 參照磁珠法全自動核酸提取試劑盒說明書提取SVA 病毒總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板擴增VP1 基因片段，PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳后純化回收。將純化產(chǎn)物采用BamHⅠ和SacⅠ酶切后克隆于pET-32a(+)表達載體，經(jīng)雙酶切和測序鑒定后的重組陽性質(zhì)粒命名為pET32a-VP1。

1.4 rVP1 蛋白的表達、純化及活性鑒定 將pET32a-VP1 轉(zhuǎn)入BL21 (DE3+)大腸桿菌中，選取陽性菌落在LB (Amp+)中培養(yǎng)至OD600nm0.6～0.8 時，加入終濃度為0.8 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)6 h。離心收集菌體，超聲裂解后離心分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE 電泳。采用His 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(可溶性蛋白)純化上清中的rVP1 蛋白，之后通過分子量25 ku 蛋白質(zhì)超濾離心管對rVP1 蛋白超濾濃縮，采用BCA 試劑盒測定濃縮后的重組蛋白濃度。以滅活的SVA 免疫小鼠血清(1∶200 稀釋)為一抗，山羊抗鼠IgG-HRP 為二抗，進行western blot 鑒定，以確定rVP1 蛋白與SVA 血清的反應(yīng)原性，設(shè)空載體轉(zhuǎn)化菌為陰性對照。

1.5 ELISA 最佳工作條件的優(yōu)化 采用矩陣法，分別對純化的rVP1 蛋白的包被濃度(0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL)、封閉時間(37 ℃，2 h 和4 ℃過夜)、樣品稀釋倍數(shù)(1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600)、包被液為碳酸鹽緩沖液，4 ℃過夜、兔抗豬IgG-HRP(1∶5 000、1∶10 000)稀釋，反應(yīng)時間(37 ℃，0.5 h、1 h)、TMB 顯色時間(8 min、10 min、15 min)等進行優(yōu)化，以確定ELISA 的最佳反應(yīng)條件。

1.6 臨界值的確定 采用確定的最佳工作條件檢測50 份SVA 陰性豬血清，每個樣品做3 個重復(fù)，計算OD450nm值的標(biāo)準(zhǔn)方差。計算公式為：陰陽性臨界值=陰性O(shè)D450nm平均值+3 倍標(biāo)準(zhǔn)差。

1.7 特異性試驗 利用優(yōu)化后的ELISA 方法對FMDV (O/A/Asia I)、PEDV、PCV2、PRRSV、PRV各5 份陽性血清及SVA 陽性血清進行檢測，分析其特異性。

1.8 敏感性試驗 隨機選取3 份SVA 陽性血清按照1∶50、1∶100、1∶200、 1∶400、1∶800、1∶1 600 稀釋后，采用純化后的ELISA 方法檢測，每個樣品3次重復(fù)，計算OD450nm值，根據(jù)實驗結(jié)果判斷該方法的敏感性。

1.9 重復(fù)性試驗 采用同一批次包被的ELISA 反應(yīng)板對10 份豬血清樣品(SVA 陽性、陰性血清各5份)進行檢測，每份樣品重復(fù)檢測3 次；同時采用3個不同批次的ELISA 反應(yīng)板重復(fù)以上試驗，根據(jù)以上檢測結(jié)果計算批內(nèi)和批間變異系數(shù)。

1.10 符合率試驗 利用血清中和(VN)試驗與本研究建立的ELISA 方法同時對43 份豬血清(33 份來自免疫豬血清，10 份來自健康豬血清)進行檢測。計算本研究與VN 試驗的符合率[15]。

1.11 臨床樣品檢測 利用建立的ELISA 方法檢測205 份臨床豬血清樣品，每個樣品重復(fù)3 次，取OD450nm值平均值作為每個樣品檢測結(jié)果。

1.12 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20 軟件分析，實驗數(shù)據(jù)差異性分析采用t檢驗或者ANOVA分析，采用方差分析各組間的差異性比較。

2 結(jié) 果

2.1 VP1 基因的擴增及重組表達載體的構(gòu)建 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，在約900 bp 處出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期VP1 基因大小相符。pET32a-VP1 經(jīng)雙酶切鑒定，在約900 bp 處有一條目的條帶(圖1)。經(jīng)測序比對分析，與GenBank 中SVA VP1 同源性99%以上。表明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖1 VP1 基因的擴增及pET32a-VP1 的酶切鑒定Fig.1 PCR amplification of SVA VP1 gene and restrictive enzyme digestion of recombinant pET32a-VP1 plasmid

2.2 rVP1 蛋白的表達、純化及活性鑒定 pET32a-VP1/BL21 經(jīng)誘導(dǎo)表達后利用SDS-PAGE 進行檢測，結(jié)果顯示，rVP1 以包涵體和可溶性表達兩種形式存在(圖2)。對可溶性蛋白經(jīng)純化濃縮后SDS-PAGE檢測顯示在51.0 ku (包括表達載體約18 ku 的標(biāo)簽蛋白)處有一條純化蛋白條帶，純度在96 %以上(圖3A)，BCA 法測定蛋白濃度為1.2 mg/mL。Western blot 檢測結(jié)果顯示51.0 ku 處有特異性條帶(圖3B)，表明該rVP1 蛋白具有好的反應(yīng)原性。

圖2 rVP1 蛋白表達的SDS-PAGE 檢測結(jié)果Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant VP1 protein

2.3 ELISA 最佳工作條件的優(yōu)化 間接ELISA 最佳工作條件見表1，包被液為碳酸鹽緩沖液4 ℃過夜。

2.4 臨界值的確定 利用SPSS.20 對50 份SVA 陰性豬血清OD450nm進行正態(tài)分布分析，數(shù)據(jù)介于0.098～0.269，計算OD450nm的平均值為0.196，標(biāo)準(zhǔn)差為0.029，經(jīng)計算陰陽性樣品的臨界值為0.283。

圖3 純化的rVP1 蛋白的SDS-PAGE(A)及western blot(B)分析Fig.3 Analysis of the purified recombinant VP1 protein by SDS-PAGE (A)and western blot (B)

表1 間接ELISA 最佳工作條件優(yōu)化結(jié)果Table 1 Results of optimal working conditions for indirect ELISA

圖4 陰性樣本正態(tài)分布OD450nm 分析Fig.4 Analysis of negative samples

2.5 特異性試驗結(jié)果 采用建立的ELISA 方法對FMDV (O/A/AsiaI)、PEDV、PCV2、PRRSV、PRV各5 份陽性血清檢測結(jié)果均為陰性，而對SVA 陽性血清檢測結(jié)果為陽性，且陰陽性對照均成立(表2)，表明該方法具有較強的特異性。

表2 間接ELISA 方法的特異性試驗結(jié)果Table 2 Results of specificity test of indirect ELISA

2.6 敏感性試驗結(jié)果 利用建立的ELISA 方法檢測不同稀釋倍數(shù)的SVA 陽性血清，結(jié)果顯示，經(jīng)800 倍稀釋后，檢測結(jié)果仍然大于試驗確立的臨界值，而經(jīng)1 600 倍稀釋后，樣品的OD450nm低于臨界值，因此，確定該方法的敏感性為1∶800 (圖5)。表明該檢測方法的敏感性較高。

圖5 敏感性試驗結(jié)果Fig.5 Sensitivity analysis of the indirect ELISA

2.7 重復(fù)性試驗結(jié)果 分別選取5 份SVA 陽性血清和5 份SVA 陰性血清進行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗，結(jié)果顯示批內(nèi)變異系數(shù)為1.56 %～3.24 %，批間變異系數(shù)為4.78 %～7.76 %，均小于10 % (表3)。表明該檢測方法重復(fù)性較好。

表3 間接ELISA 方法的重復(fù)性試驗結(jié)果Table 3 Results of reproducibility test of the indirect ELISA

2.8 符合率試驗結(jié)果 采用血清VN 試驗從43 份豬血清樣品中檢測出陽性血清樣品33 份，陰性血清樣品10 份；采用建立的ELISA 方法檢測出陽性血清樣品30 份，陰性血清樣品13 份。兩種方法檢測結(jié)果一致的樣品數(shù)是40 份，本研究建立的ELISA方法與VN 試驗符合率為93.02 % (表4)，表明該方法與VN 試驗符合率較高。

2.9 臨床樣品檢測情況 對205 份臨床豬血清進行檢測，每份血清做3 個重復(fù)，共檢出陽性血清樣品11 份，陽性率為5.37 %，表明河南地區(qū)存在SVA感染的風(fēng)險。

表4 間接ELISA 與中和試驗結(jié)果的比較及符合率分析Table 4 Comparison between the indirect ELISA and VN test result

3 討 論

SVA 自2015 年傳入我國以來，在我國呈蔓延勢態(tài)，因其引起的疫病臨床癥狀與口蹄疫相似，給我國養(yǎng)豬行業(yè)帶來了潛在危害。目前國內(nèi)外主要病原學(xué)方法有基于5'UTR、3D、VP1 等保守區(qū)域的普通RT-PCR 和熒光定量RT-PCR；樊曉旭等人利用重組酶聚合酶擴增技術(shù)(RPA)建立了實時熒光檢測方法[16]；Cheryl 等建立了基于SVA VP2 蛋白的間接ELISA 方法[17]。但國內(nèi)尚無成熟ELISA 檢測方法的報道。因此，研發(fā)簡便、特異、快速的ELISA 檢測方法成為目前迫切需要解決的問題。

pET-32a(+)載體可以表達可溶性和包涵體兩種形式的重組蛋白，包涵體需要冗雜的蛋白質(zhì)變性、復(fù)性途徑，且變性、復(fù)性過程容易導(dǎo)致蛋白失活[18]，可溶性表達可以有效避免上述包涵體表達的劣勢。本研究以SVA cDNA 為模板，克隆并可溶性表達了SVA 的VP1 蛋白，純化后的rVP1 純度大于96 %，其濃度可達1.2 mg/mL，經(jīng)western blot 分析，可溶性表達的rVP1 蛋白經(jīng)純化后與滅活的SVA 免疫小鼠血清具有較好的反應(yīng)原性。本研究得到的純化rVP1 蛋白濃度和純度高、活性好，為進一步開展其它基于SVA rVP1 蛋白的研究奠定了基礎(chǔ)。

間接ELISA 檢測方法對包被抗原的純度、濃度及抗體稀釋倍數(shù)等均有較高的要求，抗原的純度直接影響反應(yīng)的特異性，抗原的濃度及抗體稀釋倍數(shù)直接影響反應(yīng)的敏感性。本研究建立的ELISA 方法與FMDV (O/A/Asia I)、 PEDV、 PCV2、 PRRSV、PRV 陽性血清均無交叉反應(yīng)、血清經(jīng)1∶800 稀釋后OD450nm仍大于臨界值、批內(nèi)和批間變異度小，表明建立的ELISA 方法特異性強、敏感性高、穩(wěn)定性和重復(fù)性好。

VN 試驗是檢測SVA 的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究通過對43 份血清進行比較檢測，本研究建立的ELISA 方法共檢測出陽性血清30 份，而VN 試驗檢測出陽性血清樣品33 份，可能原因是間接ELISA 只針對于VP1 位點，而VN 試驗針對的是所有中和抗體。該ELISA 方法與VN 試驗的符合率為93.02 %，符合率較高，可以用作SVA 抗體的檢測。

由于國內(nèi)外并無SVA 疫苗防控的報道[16]，抗體檢測陽性的豬可以作為野毒感染評價的標(biāo)準(zhǔn)。本研究采用建立的ELISA 方法從205 份臨床豬血清樣品檢出11 份陽性，陽性率為5.37 %；流行病學(xué)調(diào)查顯示該11 份陽性血清分別來自于2 個豬場的發(fā)病豬，采用本實驗室建立的SVA 熒光定量PCR 方法對11 頭發(fā)病豬水泡液檢測結(jié)果均為陽性[19]；表明本研究建立的SVA ELISA 檢測方法可為臨床該病的監(jiān)測診斷提供重要手段?？紤]到建立的間接ELISA 方法與VN 試驗仍有敏感性的差異，本實驗室目前正在同時表達VP2、VP3、VP4 3 種結(jié)構(gòu)蛋白，以期能夠通過增加包被抗原的種類來提高該方法的敏感性。

本研究正確表達了具有生物學(xué)活性的可溶性SVA rVP1 蛋白，并建立了基于rVP1 蛋白的SVA 抗體間接ELISA 檢測方法。經(jīng)臨床初步應(yīng)用表明，本研究建立的ELISA 方法能夠為塞尼卡病毒病的臨床監(jiān)測診斷提供快速、特異、便捷的手段。