梅 楠，孫海偉，李允章，汪 凱，王桂軍，陳鴻軍*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，安徽合肥230036；2.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海200241)

I 群禽腺病毒(Fowl Adenovirus，F(xiàn)AdV-I)隸屬于腺病毒科禽腺病毒屬，普遍存在于雞群中，感染率高，發(fā)病率低，呈隱性感染，常作為繼發(fā)病原感染家禽，尤其當家禽免疫力低下或存在禽免疫抑制病時會使病情惡化。雞的I 群FAdV 分為A～E 5 個亞群，共有12 個血清型(血清型1～7，8a，8b，9～11)，其中血清4 型禽腺病毒(Serotype 4 fowl adenovirus，F(xiàn)AdV-4)屬于C 亞群，是我國目前主要的流行株，以心包積液- 肝炎綜合征(Hydropericardium hepatitis syndrome，HHS)為主要特征，給我國家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失[1-3]。

FAdV-I 病毒粒子的結(jié)構(gòu)蛋白中包括240 個六鄰體(Hexon)、12 個五鄰體(Penton base)、12 個纖突蛋白(Fiber)等構(gòu)成了病毒的核衣殼主體部分[4]，F(xiàn)iber是病毒粒子表面重要的纖突蛋白，有主要的抗原決定簇和次要的亞屬抗原決定簇。纖突蛋白可識別細胞膜上的特異性受體，病毒粒子通過纖突蛋白與細胞膜受體結(jié)合并侵入細胞。FAdV-4 病毒粒子具有2種不同大小的Fiber 蛋白：長纖突蛋白(Fiber-1)和短纖突蛋白(Fiber-2)。值得注意的是，F(xiàn)iber-2 在介導病毒感染的宿主細胞中發(fā)揮重要作用，其具有較好的抗原性，無毒株和強毒株的氨基酸序列差異較大，可誘導產(chǎn)生具有中和抗體[5-7]。

開展FAdV-4 特異性的血清學調(diào)查對于掌握該疫情流行情況，監(jiān)測疫苗免疫后抗體水平消長等有著重要的指導意義。目前有關(guān)FAdV-4 感染的血清學診斷方法包括：瓊脂擴散試驗(AGP)和中和試驗(SN)等。然而，AGP、SN 這兩種方法耗費時間較長、而且敏感性較低，容易受個體差異性的影響，樣品很難定量批量檢測[8]。商品化的抗體試劑盒是檢測FADV-I 的群特異性抗體，但特異性不夠強。通過對FADV-4 特異性抗原和抗體的制備，建立靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好的ELISA 檢測方法，是監(jiān)測該病的主要血清學檢測方法。本研究以2016年臨床分離的FAdV-4 強毒株Fiber-2 蛋白作為包被抗原，通過一系列實驗條件的摸索和優(yōu)化，建立了一種特異性檢測FAdV-4 抗體的間接ELISA 檢測方法，以期為該病血清學監(jiān)測和感染狀態(tài)篩查提供了簡便而高效的生物學工具。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 FAdV-4 AQ 株(KY436520)由本實驗室分離保存；pET-32a(+)、FAdV-4 陽性血清(13 份FAdV-4 滅活菌免疫雞血清，15 份FAdV-4 感染雞血清)、FAdV-8b 陽性血清和SPF 雞陰性血清均由本實驗室保存；DH5α 和BL21 (DE3)感受態(tài)細胞購自美國Invitrogen 公司；SacⅠ和Hind Ⅲ購自英國NEB 公司；DNA T4 連接酶購自美國Thermo Scientific 公司；病毒基因組提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；凝膠回收試劑盒購自德國Qiagen 公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自美國Axygen 公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；雞血清1 型FAdV (FAdV-1)陽性血清、血清9 型FAdV (FAdV-9)陽性血清、血清10 型FAdV(FAdV-10)陽性血清、血清11 型FAdV(FAdV-11)陽性血清均由葉建強教授惠贈；新城疫(ND)、雞傳染性支氣管炎(IB)、雞傳染性法氏囊(IBD)、Ⅲ群禽腺病毒—雞產(chǎn)蛋下降綜合征(EDS76)、馬立克氏病(MD)、禽白血病(AL)以及H5N1 和H9N2 亞型禽流感的陽性血清均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；羊抗雞IgG-HRP 購自Proteintech 公司；TMB 底物顯色液購自上海浩然生物技術(shù)有限公司；脫脂奶粉購自O(shè)XOID 公司。

1.2 FAdV-4 AQ 株基因組提取 按常規(guī)方法制備原代雞胚腎細胞(CEK)，接種FAdV-4 AQ 株病毒(0.1 TCID50/ 孔)，待出現(xiàn)細胞病變后收集細胞上清，分裝保存于-80 ℃，測量其效價。取出其中200 μL病毒樣品，經(jīng)病毒基因組DNA 提取試劑盒提取基因組DNA，置-20 ℃長期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3fiber-2基因的克隆與表達

1.3.1 fiber-2 基因的擴增基于FAdV-4 AQ 株(KY436520)的fiber-2基因5'端111 bp 的高親水區(qū)域影響該蛋白在pET-32a(+)載體中的表達效率，本實驗從fiber-25' 端112 bp 處開始設(shè)計一對特異性引物。fiber-2-F：CATGAGCTCATGCTTGACCTGGTTT ATCCTTTCG (SacⅠ)/fiber-2-R：CATAAGCTT TTA CGGGAGGGAGGCC (Hind Ⅲ)。并分別在上下游引物的5' 端和3' 插入SacⅠ和Hind Ⅲ酶切位點。以FAdV-4 AQ 株基因組DNA 為模板，PCR 擴增fiber-2基因的112 bp～1 440 bp 片段。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖核酸凝膠電泳檢測并回收純化。

1.3.2 pET32a-fiber-2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建將PCR 擴增產(chǎn)物與pET-32a(+)空載體分別經(jīng)SacⅠ/Hind Ⅲ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖核酸凝膠電泳膠回收，將載體和目的片段按1∶3 摩爾比混合后連接，取部分連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細胞，挑單菌落培養(yǎng)，并用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pET32a-fiber-2，PCR鑒定后由蘇州金唯智公司測序。

1.3.3 Fiber-2 蛋白表達及純化將1.3.2 中測序正確的pET32a-fiber-2和pET-32a 空載體分別轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，挑單菌落培養(yǎng)，于37 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)至OD600nm值達0.4～0.6 時，加入終濃度1 mmol/L IPTG 誘導，6 h 后3 000 r/min 離心收集菌體，經(jīng)超聲波破碎裂解后收集沉淀和裂解上清，經(jīng)SDS-PAGE 電泳檢測重組蛋白的表達情況。產(chǎn)物經(jīng)鎳柱純化后采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒確定濃度。

1.4 Fiber-2 間接ELISA 方法的建立 采用方陣法對包被抗原Fiber-2 蛋白包被量(0.01 μg、0.02 μg、0.05 μg、0.1 μg、0.2 μg、0.4 μg、0.8 μg 和1.6 μg)、包被條件(37 ℃包被1 h 后，4 ℃放置12 h；37 ℃包被2 h 后，4 ℃放置12 h；4 ℃放置12 h)、封閉液(5 %脫脂奶或1 %牛血清白蛋白)、封閉時間(30 min、60 min 或120 min)、血清孵育時間(30 min、60 min、90 min、120 min)、羊抗雞IgG-HRP 二抗稀釋倍數(shù)(1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000和1∶32 000)、二抗孵育時間(30 min、60 min、90 min、120 min)等進行優(yōu)化，建立檢測FAdV-4 抗體的間接ELISA 方法。

1.5 陰性、陽性臨界值的確定 根據(jù)已確定的上述ELISA 最佳條件，對60 份SPF 雞血清進行檢測，測定其OD450nm，計算60 份樣品OD450nm平均值(X)和標準差(SD)，計算臨界值=X+3SD。

1.6 特異性試驗 利用建立的間接ELISA 方法檢測ND、 IB、 IBD、 EDS76、 MD、 AL、 FAdV-1、FAdV-7、FAdV-9、FAdV-11、FAdV-8b、H5N1 和H9N2 亞型流感等陽性血清，以FAdV-4 陽性和陰性血清為對照，驗證該方法特異性。

1.7 敏感性試驗 將FAdV-4 陽性血清和陰性血清分別從1∶100 倍比稀釋至1∶51 200，采用本實驗建立的間接ELISA 方法進行檢測，評價該方法敏感性。

1.8 重復性試驗 取4 份陽性血清和1 份陰性血清，利用同一批次制備的抗原包被板檢測每個樣品重復3 個孔，在不同時間段進行批內(nèi)重復性檢測；同時，取該4 份陽性血清和1 份陰性血清，每個樣品重復3 個孔，以不同批次制備的抗原包被板同一時間段進行批間重復性檢測，評估該方法的重復性。

1.9 臨床樣品檢測 利用本實驗建立的間接ELISA檢測方法對免疫FAdV-4 滅活苗的13 份雞血清和實驗室保存的15 份FAdV-4 感染的雞的陽性血清以及12 份SPF 雞陰性血清進行檢測；同時利用瓊脂擴散(AGP)實驗(瓊擴抗原為AQ 株病毒感染的雞肝臟混懸液)對上述樣品進行檢測。將二者檢測結(jié)果進行對比分析，并確定兩種方法的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 pET32 a-fiber-2重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定FAdV-4 AQ 株經(jīng)CEK 細胞增殖培養(yǎng)，48 h 產(chǎn)生明顯CPE，提取病毒DNA，以其為模板，PCR 擴增fiber-2基因112 bp～1 440 bp 片段。結(jié)果顯示得到1 314 bp 的目的條帶(圖1)，與pET-32a(+)載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a-fiber-2，PCR 鑒定結(jié)果顯示：擴增得到約1 300 bp 的目的條帶。經(jīng)測序結(jié)果顯示，克隆入pET-32a(+)載體中的fiber-2基因片段與FAdV-AQ 株(KY436520)fiber-2基因的同源性為100%。表明重組質(zhì)粒pET32a-fiber-2構(gòu)建正確。

圖1 fiber-2 截短基因的PCR 擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of truncated fiber-2 gene

2.2 Fiber-2 的表達與純化 重組菌pET32a-fiber-2/BK21 經(jīng)IPTG 誘導后，超聲波破碎后離心，取菌體上清和細菌沉淀，經(jīng)SDS-PAGE 檢測，結(jié)果顯示重組菌中Fbier-2 獲得高水平表達，重組蛋白的分子量大小約為70 ku(圖2)，經(jīng)純化后，濃度為0.7 mg/mL。

2.3 Fiber-2 間接ELISA 方法的建立 經(jīng)反應(yīng)優(yōu)化，確定Fiber-2 蛋白最佳包被量為0.1 μg/ 孔，最佳包被條件為37 ℃包被2 h，4 ℃靜置12 h；最佳封閉液為：5 %脫脂乳，封閉時間為2 h；血清最佳稀釋度為1∶200；血清最佳孵育時間為30 min；羊抗雞IgG-HRP 二抗最佳稀釋度為1∶2 000，最佳孵育時間為30 min。

圖2 重組菌pET32a-fiber-2/BL21 SDS-PAGE 分析Fig.2 SDS-PAGE analysis

2.4 間接ELISA 陰陽性臨界值的確定 采用優(yōu)化的ELISA 實驗條件檢測60 份SPF 雞陰性血清(圖3)，測定的OD450nm平均值為0.0842，標準差為0.0182，按照臨界值公式計算該方法臨界值為：0.139。即當樣品的OD450nm值大于等于0.139 可視為陽性，小于0.139 為陰性，介于之間的為可疑。

圖3 陰性血清OD450nm 的正態(tài)分布圖Fig.3 Normal distribution of negative serum based on OD450nm level

2.5 特異性試驗 采用建立的間接ELISA 方法檢測ND、IB、IBD、EDS76、MD、AL 以及H5N1 和H9N2 亞型流感陽性血清，同時設(shè)立FAdV-4 陽性血清和陰性對照。結(jié)果顯示：以Fiber-2 作為包被抗原的間接ELISA 方法，與上述血清均無交叉反應(yīng)，僅與FAdV-4 陽性血清反應(yīng)(圖4)。表明建立的間接ELISA 方法有較強的特異性。

2.6 敏感性試驗 將FAdV-4 陽性血清從1∶100 倍比稀釋至1∶51 200，按照本實驗確定的最佳反應(yīng)條件進行ELISA 檢測。結(jié)果顯示，當FAdV-4 陽性血清稀釋至1∶12 800 時，檢測結(jié)果仍為陽性(圖5)。表明建立的ELISA 檢測方法具有較高的敏感性。

圖4 ELISA 特異性試驗結(jié)果Fig.4 Detection of specificity of ELISA

圖5 敏感性試驗結(jié)果Fig.5 Sensitivity detection

2.7 重復性試驗 采用建立的ELISA 方法對4 份陽性血清和1 份陰性血清進行批內(nèi)重復試驗和批間重復試驗，結(jié)果顯示：批內(nèi)重復試驗的變異系數(shù)在2.98 %～6.70 %，而批間重復試驗的變異系數(shù)在0.66 %～5.09 %，變異系數(shù)均小于10 % (表1)。表明該間接ELISA 檢測方法具有較好的重復性。

2.8 臨床血清樣品檢測結(jié)果 采用本實驗建立的ELISA 檢測方法和AGP 抗體檢測方法，分別對臨床血清樣品進行檢測。結(jié)果顯示：13 份FAdV-4 滅活苗的免疫血清和15 份雞血清均為陽性，12 份陰性血清均為陰性，AGP 實驗同樣顯示：13 份免疫FAdV-4 滅活苗的雞血清和15 份雞血清均為陽性。AGP 效價均在1∶8～1∶32，而12 份陰性血清結(jié)果則呈現(xiàn)雙陰性。結(jié)果顯示，ELISA 檢測結(jié)果與AGP 試驗結(jié)果100 %相符，表明基于Fiber-2 的間接ELISA檢測方法可以用于FAdV 臨床血清學監(jiān)測。

表1 批內(nèi)和批間重復性試驗結(jié)果(n=5)Table 1 Results of intra- and inter- assay repeatability test (n=5)

3 討 論

自2015 年至今，由FAdV-4 在我國大面積流行，引起雞的心包積液綜合征(Hydropericardium syndrome，HPS)和包涵體肝炎(Inclusion body hepatitis in chicken，IBH)[1-2]，嚴重危害我國養(yǎng)雞業(yè)。在感染雞的FAdV 12 種血清型中，F(xiàn)AdV-4 是主要的流行株。滅活疫苗可以用于防控該病流行[7]，為了特異性監(jiān)測該病的免疫效果，急需建立特異的FAdV-4 血清學檢測方法。

馬洪濤等應(yīng)用FAdV-4 病毒作為包被抗原，建立了檢測FAdV 的方法，但是用全病毒包被加大了散毒的風險，增加了生物安全危害[8]。謝泉建立了以Hexon 蛋白為包被抗原的檢測FAdV 的ELISA 方法，但是陽性血清檢出率不高，分析可能是Hexon蛋白自身無法刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)的抗原，從而影響陽性血清的檢出[9]。

在FAdV 的其它結(jié)構(gòu)蛋白中，F(xiàn)iber 在FAdV 的感染與致病過程中扮演著重要的角色，與毒力增強相關(guān)[5-6]。FAdV-4 基因組包含兩個fiber基因，分別是fiber-1和fiber-2，兩個基因分別編碼長纖突和短纖突，兩個蛋白的多肽圖譜也不相同[10]。Fiber-2 對病毒的增殖、組裝或擴增中的某些階段十分必要，有研究發(fā)現(xiàn)缺乏Fiber-2 導致病毒粒子無法形成[7]。纖突蛋白中含有FAdV 的重要抗原表位，有主要的種特異性抗原決定簇和次要的亞屬特異性抗原決定簇，可誘導中和抗體的產(chǎn)生[10]。

本研究對FAdV-4 AQ 株的fiber-2基因進行原核表達，隨后以Fiber-2 蛋白作為包被抗原，建立了以Fiber-2 作為檢測抗原的間接ELISA 檢測方法。該方法對NDV、IBV、IBDV、EDSV、MDV、ALV 以及H5 和H9 的亞型流感陽性血清均無交叉反應(yīng)，也與其它FAdV 血清型的特異性抗體無交叉反應(yīng)，該方法具有較強的特異性。在重復性試驗中，批內(nèi)重復試驗的變異系數(shù)在2.98 %～6.70 %，批間重復試驗的變異系數(shù)在0.66 %～5.09 %，均小于10 %，具有較好的重復性。在臨床試驗中，間接ELISA 試驗結(jié)果與AGP 結(jié)果符合率100 %。本研究建立的ELISA檢測方法具有良好的檢測效果，可以廣泛應(yīng)用到特異性FAdV-4 抗體的臨床檢測中。