王 青，徐彥召，楊 磊，董萌萌，白躍宇，趙 坤，胡建和*，張文舉

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子832003；2.河南科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003)

抗生素耐藥菌株、“超級(jí)細(xì)菌”的出現(xiàn)對(duì)世界公共衛(wèi)生造成了嚴(yán)重的威脅；研究發(fā)現(xiàn)耐藥基因可以在細(xì)菌之間發(fā)生交換，導(dǎo)致更多耐藥菌株的出現(xiàn)，加劇了細(xì)菌對(duì)動(dòng)物和人類健康的危害[1-2]。傳統(tǒng)抗生素通常通過(guò)干擾或阻斷細(xì)菌正常的代謝過(guò)程殺滅細(xì)菌；然而，細(xì)菌往往可以通過(guò)改變遺傳結(jié)構(gòu)和抗生素靶標(biāo)位點(diǎn)，避免或抵抗抗生素的作用[3]。抗菌肽(Antimicrobial peptide，AMPs)是機(jī)體先天免疫系統(tǒng)的組成部分，伴隨著不斷從各種生物體和組織中分離和鑒定出新的AMPs，研究人員研究了AMPs的結(jié)構(gòu)與活性之間的關(guān)系[4]。雖然它們的作用方式尚未完全被熟知，但被廣泛認(rèn)可的作用機(jī)制是它們以細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)膜為靶目標(biāo)，通過(guò)靜電相互作用吸附在脂質(zhì)雙層上。AMPs 以低聚體的形式插入細(xì)菌細(xì)胞膜，從而形成跨膜通道，最終破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜。由于膜是細(xì)胞存活的重要屏障，并且膜的完整性對(duì)于細(xì)菌的生長(zhǎng)至關(guān)重要，AMPs 通常通過(guò)該種方式殺死細(xì)菌[5]。因此，細(xì)菌對(duì)AMPs 不易產(chǎn)生耐藥性。但AMPs 的抗菌活性與溶血性之間存在一定相關(guān)性，抗菌活性越好，對(duì)細(xì)胞毒性就越大[6]。因此，需要尋找具有良好抗菌活性且低細(xì)胞毒性的AMPs 替代傳統(tǒng)抗生素。相關(guān)報(bào)道顯示，整個(gè)血紅蛋白分子不具有抗菌活性，但一些血紅蛋白片段有抗菌活性[7]。本實(shí)驗(yàn)室前期從牛紅細(xì)胞的血紅蛋白α 亞基中分離得到了AMPs P3[8]，本研究檢測(cè)了P3類似物HJH-3 的抗菌活性，且觀察了HJH-3 對(duì)細(xì)菌形態(tài)學(xué)的影響，測(cè)定了HJH-3 對(duì)細(xì)菌跨膜電位的影響，從而闡明了HJH-3 的破膜機(jī)理，為AMPs 的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 AMPs 與菌種 P3 類似物HJH-3[8]由本實(shí)驗(yàn)室合成；AMPs Pexiganan 購(gòu)自吉爾生化(上海)有限公司。大腸桿菌(Escherichia coli)ATCC25922 株、大腸桿菌臨床分離株、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC29213 株、金黃色葡萄球菌臨床分離株、 雞白痢沙門氏菌(Salmonella pullorum)BNCC124693 株、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhoid)CVCC541 株、沙門氏菌(Salmonell)臨床分離株和白色念珠菌(Canidia Albicans)ATCC90029 株均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料 TSB 培養(yǎng)基和Sabouraud's agar培養(yǎng)基購(gòu)自上海創(chuàng)賽科技有限公司；Triton X-100、PI、雙-(1，3- 二丁基巴比妥酸)三甲胺肟醇[DiBAC4(3)]均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；瓊脂糖購(gòu)自基因集團(tuán)上海貝晶生物技術(shù)有限公司。固相多肽合成儀為美國(guó)GENE Tribute 公司產(chǎn)品；超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀為美國(guó)Waters 公司產(chǎn)品。

1.3 AMPs HJH-3 的合成與純化 根據(jù)AMPs HJH-3 已知的氨基酸序列：VNFKLLSHSLLVTL RSHL，利用在線ProtParam 軟件對(duì)AMPs HJH-3 進(jìn)行理化性質(zhì)信息的分析；利用ProtScale 在線軟件對(duì)AMPs HJH-3 進(jìn)行疏水性預(yù)測(cè)；利用9- 芴甲氧羰基(F-moc)固相化學(xué)合成法通過(guò)多肽合成儀制備AMPs HJH-3 (VNFKLLSHSLLVTLRSHL)。用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)對(duì)所制備的肽進(jìn)行純化，純度≥95 %；再利用質(zhì)譜儀測(cè)定合成物質(zhì)的分子質(zhì)量。

1.4 AMPs HJH-3 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 分別挑取待測(cè)的大腸桿菌(ATCC25922)、臨床大腸桿菌、金黃色葡萄球菌(ATCC29213)、臨床金黃色葡萄球菌、雞白痢沙門氏菌、臨床沙門氏菌和白色念珠菌(ATCC90029)的單菌落，按照CLSI 標(biāo)準(zhǔn)[9]操作，檢測(cè)AMPs HJH-3 對(duì)上述各種菌的抑制作用。

1.5 AMPs HJH-3 溶血活性的檢測(cè) 采集兔耳靜脈血液，800 r/min 離心5 min，棄去上清液，分離紅細(xì)胞。將分離的紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌3 次至上清液透明，制得紅細(xì)胞懸液。將AMPs HJH-3 溶液與5%(V/V)紅細(xì)胞懸液等體積混合，37 ℃孵育1 h。用1%Triton X-100 處理的紅細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照(100%溶血)；未經(jīng)AMPs 處理的紅細(xì)胞作為陰性對(duì)照(無(wú)溶血)。通過(guò)測(cè)定紅細(xì)胞在OD414nm處的吸光度來(lái)檢測(cè)AMPs HJH-3 溶血活性。并與商品化的AMPs Pexiganan 的溶血活性進(jìn)行比較。計(jì)算方法為(OD414nm肽-OD414nm陰性對(duì)照)/(OD414nm陽(yáng)性對(duì)照-OD414nm陰性對(duì)照)。

1.6 AMPs HJH-3 穩(wěn)定性的測(cè)定 以大腸桿菌ATCC25922 株為試驗(yàn)菌株，采用瓊脂糖擴(kuò)散法[10]，將濃度為1 mg/mL 的AMPs HJH-3 分別在0、20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃和100 ℃下孵育20 min，測(cè)定AMPs HJH-3 的熱穩(wěn)定性；將濃度為1 mg/mL 的AMPs HJH-3 在pH 分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 的LB 培養(yǎng)基中孵育20 min，測(cè)定AMPs HJH-3 的酸堿耐受性；將濃度為1 mg/mL的AMPs HJH-3 分別在250 mmol/L、200 mmol/L、150 mmol/L、100 mmol/L、50 mmol/L 的NaCl 溶液中孵育20 min，測(cè)定AMPs HJH-3 的離子強(qiáng)度穩(wěn)定性。在加入覆蓋瓊脂糖之前，立即使用游標(biāo)卡尺測(cè)量所有樣品的初始直徑(Do)。培養(yǎng)24 h 后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量生長(zhǎng)抑制區(qū)的直徑(Di)。所得抑制率(Di-Do)反映了AMPs HJH-3 的穩(wěn)定性。

1.7 AMPs HJH-3 對(duì)膜電位影響的檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌ATCC25922 株和金黃色葡萄球菌ATCC29213 株分別與5 mmol/L 的DiBAC4(3)在37 ℃的HEPES 溶液中孵育40 min，將終濃度為50 μg/mL AMPs加入到上述懸浮液中。不加抗菌肽的上述懸液為陰性對(duì)照。使用酶標(biāo)儀以30 s 的時(shí)間間隔收集熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，測(cè)定AMPs對(duì)細(xì)胞膜電位的影響。

1.8 AMPs HJH-3 對(duì)細(xì)菌膜通透性影響的檢測(cè)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌ATCC25922 株和金黃色葡萄球菌ATCC29213 株分別與50 μg/mL 的AMP-sHJH-3 混合，在37 ℃孵育30 min；陰性對(duì)照組為細(xì)菌與PBS 混合，其它條件相同。將PI(100 μg/mL)添加到所有樣品中，并將懸浮液在37 ℃孵育10 min，熒光顯微鏡下觀察樣品。通過(guò)測(cè)量細(xì)菌對(duì)PI 的吸收來(lái)測(cè)定膜滲透性。

1.9 AMPs HJH-3 對(duì)細(xì)菌形態(tài)的影響 將經(jīng)過(guò)磷酸鹽緩沖液洗滌的大腸桿菌ATCC25922 株和金黃色葡萄球菌ATCC29213 株(106cfu/mL)分別與HJH-3 混合后在37 ℃培養(yǎng)1 h，洗滌并收集菌體，采用2.5%(v/v)戊二醛固定3 h，將細(xì)菌滴加到直徑為8 mm 的蓋玻片上，依次在30%、60%、70%、80%、90%和100 %、100 % (v/v)乙醇中梯度脫水各15 min 后在冷凍干燥儀中干燥，按常規(guī)操作，通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察。同時(shí)，收集用HJH-3 處理過(guò)的上述兩種細(xì)菌，經(jīng)固定、脫水、浸透、包埋、修塊、切片、電子染色等步驟，通過(guò)透射電子顯微鏡觀察。

2 結(jié) 果

2.1 AMPs HJH-3 的合成與純化 通過(guò)在線Prot-Param 軟件和ProtScale 軟件分別對(duì)AMPs HJH-3 進(jìn)行理化性質(zhì)分析和疏水性預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，AMPs HJH-3 的分子式為C96H161N27O24，含有18 個(gè)氨基酸殘基，由9 種基本氨基酸組成，分子量為2 027.44 Da。帶正電荷的殘基(Arg+Lys+His)數(shù)有2 個(gè)，不含帶負(fù)電荷的殘基(Asp+Glu)；其半衰期：在哺乳動(dòng)物、網(wǎng)狀細(xì)胞(體外)中大于100 h，在酵母(體內(nèi))中為20 h以上，在大腸桿菌(體內(nèi))中為10 h 以上；AMPs HJH-3 的不穩(wěn)定指數(shù)為18.42，脂溶性指數(shù)(Aliphatic index)為162.22，表明HJH-3 是一種穩(wěn)定性較好且耐熱的AMPs。對(duì)合成的AMPs HJH-3 采用反相高效液相色譜法進(jìn)行純化，純度為95 % (圖1)，再利用質(zhì)譜儀測(cè)定了HJH-3 的分子量，分別在693.14 Da和1039.56 Da 的+3 和+2 電荷態(tài)出現(xiàn)兩個(gè)主要峰(圖2)，表明合成的HJH-3 與預(yù)期分子質(zhì)量一致。

圖1 RP-HPLC 純化AMPs HJH-3Fig.1 Purification of antimicrobial peptide HJH-3 by RP-HPLC

2.2 AMPs HJH-3 的MIC 測(cè)定結(jié)果 按照CLSI 標(biāo)準(zhǔn)[11]分別檢測(cè)了 AMPs HJH-3 對(duì)大腸桿菌(ATCC25922)、臨床大腸桿菌、金黃色葡萄球菌(ATCC29213)、臨床金黃色葡萄球菌、雞白痢沙門氏菌、臨床沙門氏菌和白色念珠菌(ATCC90029)的MIC，結(jié)果顯示，AMPs HJH-3 在6.25 μg/mL～50 μg/mL范圍內(nèi)，對(duì)上述各菌均有抑制作用(表1)。表明HJH-3 是一種廣譜的AMPs，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、真菌均有不同程度的抑制作用。

圖2 質(zhì)譜檢測(cè)AMPs HJH-3Fig.2 Analysis of antimicrobial peptide HJH-3 by mass spectrometry

表1 AMPs HJH-3 對(duì)各菌株的MIC 檢測(cè)結(jié)果Table 1 MIC test results of antimicrobial peptide HJH-3 against representative strains

2.3 AMPs HJH-3 溶血活性的檢測(cè) 利用制備的紅細(xì)胞懸液與HJH-3 溶液共孵育，通過(guò)測(cè)定紅細(xì)胞在OD414nm處的吸光度來(lái)檢測(cè)AMPs HJH-3 的溶血活性。結(jié)果顯示，即使在400 μg/mL (大于5 MIC)條件下作用1 h，AMPs HJH-3 的溶血率仍低于10 %；而商品化的AMPs Pexiganan 在100 μg/mL 時(shí)，其溶血性率為45.4 %，在400 μg/mL 時(shí)，其溶血率為56.9 % (圖3)。表明抗菌肽HJH-3 對(duì)兔紅細(xì)胞的溶血活性較低、毒性小。

圖3 AMPs HJH-3 的溶血性檢測(cè)Fig.3 Hemolytic effects of the antimicrobial peptide HJH-3

2.4 AMPs HJH-3 穩(wěn)定性的測(cè)定結(jié)果 以大腸桿菌ATCC25922 株為試驗(yàn)菌株，采用雙層瓊脂擴(kuò)散法[12]，測(cè)定AMPs HJH-3 分別對(duì)不同的溫度、酸堿度和離子強(qiáng)度的耐受性。結(jié)果顯示，HJH-3 在不同溫度下處理30 min，抗菌活性隨溫度的升高而降低，但其在100 ℃處理30 min 后仍具有較好的抑菌活性(圖4A)；HJH-3 在pH 值為7 時(shí)具有最強(qiáng)的抗菌活性，當(dāng)pH 值為4～7 和7～10 時(shí)仍具有抗菌活性(圖4 B)；當(dāng)NaCl 溶液的濃度略大于或小于0.9 % (W/V，154 mmol/L)時(shí)HJH-3 的活性略降低(圖4 C)。由此表明，AMPs HJH-3 具有較好的熱穩(wěn)定性，在較寬的酸堿度范圍內(nèi)均可以發(fā)揮抗菌作用，離子濃度對(duì)HJH-3 的活性沒(méi)有明顯的影響。

圖4 AMPs HJH-3 的穩(wěn)定性檢測(cè)Fig.4 Stability tests of the antimicrobial peptide HJH-3

2.5 AMPs HJH-3 對(duì)膜電位影響的檢測(cè)結(jié)果 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌ATCC25922 株和金黃色葡萄球菌ATCC29213 株分別與5 mmol/L 的DiBAC4(3)混合孵育40 min 時(shí)加入AMPs，測(cè)量其熒光強(qiáng)度，結(jié)果顯示，當(dāng)加入HJH-3 時(shí)，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的熒光強(qiáng)度立即增加，而不加AMPs 的對(duì)照組則維持固定的膜電位(圖5)。表明AMPs 能夠使細(xì)菌細(xì)胞膜迅速去極化，從而破壞了膜的完整性。

圖5 AMPs 作用細(xì)胞后細(xì)胞膜去極化檢測(cè)Fig.5 Depolarization effects on cell membrane upon action of antimicrobial peptides

2.6 AMPs HJH-3 對(duì)細(xì)菌膜通透性影響的檢測(cè)結(jié)果測(cè)定 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌ATCC25922 株和金黃色葡萄球菌ATCC29213 株分別與50 μg/mL 的AMPs HJH-3 混合后于熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示，與AMPs 作用后的大腸桿菌(圖6A)和金黃色葡萄球菌(6 C)均產(chǎn)生了紅色熒光，而未與AMPs 作用的大腸桿菌(圖6B)和金黃色葡萄球菌(圖6D)均無(wú)熒光產(chǎn)生。表明AMPs 破壞了細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性。

2.7 AMPs HJH-3 對(duì)細(xì)菌形態(tài)的影響 將經(jīng)過(guò)抗菌肽HJH-3 處理的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌經(jīng)掃描電子顯微鏡觀察可見，HJH-3 能夠穿透大腸桿菌的膜，形成許多“孔洞”(圖7B)。對(duì)于金黃色葡萄球菌，HJH-3 能夠使其細(xì)胞受損、黏連(圖7D)。陰性對(duì)照組大腸桿菌(圖7A)和金黃色葡萄球菌(圖7C)細(xì)胞表面光滑、結(jié)構(gòu)完整。

同時(shí)，收集HJH-3 作用后的上述兩種細(xì)菌，利用透射電子顯微鏡觀察可見，大腸桿菌(圖8B)和金黃色葡萄球菌(圖8D)的細(xì)胞膜出現(xiàn)了明顯的破損，細(xì)胞內(nèi)容物釋放出來(lái)。未經(jīng)HJH-3 處理的大腸桿菌(圖8A)和金黃色葡萄球菌(圖8C)細(xì)胞表面光滑完整，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)完整。

圖8 AMPs HJH-3 作用后細(xì)菌透射電鏡檢測(cè)Fig.8 TEM micrographs of bacterial cells treated with antimicrobial peptides HJH-3

上述兩種試驗(yàn)方法均表明，AMPs HJH-3 能夠破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)菌變形、破裂、黏連，從而對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生抑制、殺滅作用。

3 討 論

AMPS 是傳統(tǒng)抗生素的替代物。然而，許多天然的AMPs 均是小分子物質(zhì)，盡管多肽合成技術(shù)已經(jīng)比較成熟，但在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中其主要由試劑公司合成，合成成本相對(duì)較高，交貨時(shí)間也比較長(zhǎng)，從而限制了其臨床應(yīng)用。本研究所選取的HJH-3 是一種分子量為2.02 ku 的堿性肽，含有18 個(gè)氨基酸，由本實(shí)驗(yàn)室人員通過(guò)軟件分析氨基酸合成的難易程度，合理安排氨基酸羧化反應(yīng)的時(shí)間，使用所擁有的全自動(dòng)多肽合成儀自主合成，從而降低了研究成本，節(jié)約了時(shí)間。

AMPs 對(duì)微生物的抑制作用可以通過(guò)多種模式實(shí)現(xiàn)，但目前得到廣泛認(rèn)可的是AMPs 的細(xì)胞作用機(jī)制。研究者歸納了AMPs 的4 種不同的膜作用模型，如：板- 桶模型、環(huán)形孔模型、地毯模型、凝聚模型等。其中，“板-桶模型”膜作用機(jī)制認(rèn)為：帶正電荷的抗菌肽，首先通過(guò)靜電吸引作用聚集在細(xì)胞膜表面，并在細(xì)胞膜上堆積形成多聚體；其次，AMPs 聚集體的疏水基團(tuán)嵌入細(xì)胞膜的磷脂雙分子層中形成跨細(xì)胞膜通道，細(xì)胞膜的完整性被破壞；最后，細(xì)胞內(nèi)外滲透壓發(fā)生改變或者細(xì)胞內(nèi)容物泄露等情況，最終細(xì)胞崩解死亡。研究證實(shí)AMPs Hf-1、AMPs SK84、AMPs Ctx-Ha 等均采用該種模式起到殺菌作用[13-14]?！碍h(huán)形孔模型”認(rèn)為：AMPs 分子可以不通過(guò)靜電吸引作用即可以插入細(xì)菌的細(xì)胞膜內(nèi)(同時(shí)改變細(xì)胞膜的表面張力)，形成環(huán)孔狀通道貫通外脂質(zhì)雙層分子，最終導(dǎo)致靶細(xì)菌的死亡。研究證實(shí)，Magainins、Protegrins 和蜂毒素Melittin 是通過(guò)“環(huán)孔”模型發(fā)揮殺菌作用的[15-16]?！暗靥耗Ｐ汀敝赋?，抗菌肽首先以“平鋪”的形式分布于細(xì)菌細(xì)胞膜表面，并逐步堆集致使細(xì)菌細(xì)胞膜表面張力發(fā)生改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜出現(xiàn)破裂。抗菌肽Dermaseptin、 Bactenecin 、Aurein 1.2 、Cecropin P1 均是采用該種作用模式[17-18]?！澳勰Ｐ汀敝赋?，AMPs 以分子團(tuán)的形式聚在細(xì)胞膜的表面，并與細(xì)胞膜上磷脂分子形成肽- 脂質(zhì)分子復(fù)合物，膜兩側(cè)由于電勢(shì)差的存在而逐漸形成跨膜孔洞，最終導(dǎo)致靶細(xì)菌死亡。AMPs HJH-3 作用細(xì)菌的膜電位監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，帶有正電荷的抗菌肽HJH-3 作用細(xì)菌后，可以迅速導(dǎo)致細(xì)菌的去極化；膜通透性結(jié)果顯示，不能透過(guò)完整細(xì)胞膜的PI 染料可以和細(xì)菌胞內(nèi)DNA 結(jié)合，說(shuō)明細(xì)菌在HJH-3 的作用下，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變；掃描電鏡確認(rèn)了AMPs 可以造成細(xì)菌細(xì)胞膜表面出現(xiàn)孔洞或裂隙，透射電子顯微鏡進(jìn)一步確認(rèn)了細(xì)菌細(xì)胞膜的裂解；由以上結(jié)果可以推測(cè)，AMPs HJH-3 對(duì)細(xì)胞的破壞作用可能是采用“板-桶模型”作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜。

本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，HJH-3 不僅抗菌活性較高，同時(shí)對(duì)紅細(xì)胞的毒性較低，這可能與其特殊的氨基酸序列有關(guān)。通過(guò)分析，在牛紅細(xì)胞血紅蛋白α 亞單位的同一區(qū)域與人和豬的氨基酸具有高度同源性[14]。同時(shí)，HJH-3 肽鏈總體趨向于親水性。因此，HJH-3寡聚體與紅細(xì)胞膜的結(jié)合較弱，從而對(duì)紅細(xì)胞的毒性較低。

本研究初步探明了AMPs HJH-3 抑菌作用機(jī)制，證實(shí)了AMPs HJH-3 可以破壞細(xì)菌膜的完整性從而表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌活性，同時(shí)該AMPs 穩(wěn)定性好，溶血作用較弱。由此推測(cè)HJH-3 作為一種新的抗菌劑具有廣闊的應(yīng)用前景，從而為AMPs 的開發(fā)利用奠定了理論基礎(chǔ)。