趙玉博，陳普成，胡玉珍，丁蕾蕾，王 波，焦晨晨，姜永萍，陳化蘭，柳金雄

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150069)

鴨病毒性腸炎病毒(Duck enteritis virus，DEV)又稱鴨瘟病毒，屬皰疹病毒，其基因組龐大，可供外源基因插入的復(fù)制非必需區(qū)多，是良好的活病毒載體[1]。

關(guān)于DEV 基因組復(fù)制非必需區(qū)的已有研究表明，UL27 與UL26 之間、LORF11 與UL55 之間、SORF3 與US2 之間和US7 與US8 之間的相關(guān)位點(diǎn)可以作為良好的外源基因插入位點(diǎn)[2-3]。因此，本實(shí)驗(yàn)室前期在DEV 基因組US7 與US8 之間發(fā)現(xiàn)適合外源基因插入的位點(diǎn)，并構(gòu)建出可作為疫苗株的重組病毒[4]。

反向遺傳操作技術(shù)可以在DNA 或RNA 水平對(duì)病毒基因進(jìn)行修飾和改造，然后通過拯救出病毒的表型變化來判斷基因操作的效果，從而對(duì)病毒基因組表達(dá)調(diào)控機(jī)制、病毒致病的分子機(jī)理等進(jìn)行研究[5-6]。

探尋DEV 基因組中可供外源基因插入的位點(diǎn)具有重要意義。為了探索其更多可利用位點(diǎn)，本研究利用反向遺傳技術(shù)，篩選到DEV 基因組復(fù)制非必需區(qū)適合外源基因插入的位點(diǎn)，為構(gòu)建以DEV 為載體的疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 DEV 拯救系統(tǒng)的5 個(gè)粘粒(即pFosT、pFosH、pFosJ、pFosQ、pFosD)和重組質(zhì)粒pENTR-SV40 由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；DEV AV1222疫苗株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；DEV AV1221 強(qiáng)毒株購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC)；9 日齡～10 日齡SPF 雞胚和實(shí)驗(yàn)所用的SPF 鴨均由哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑表達(dá)紅色熒光蛋白(RFP)的pDsred2-N1 質(zhì)粒購自Clontech 公司；含有CCDB 基因的Gateway 試劑盒購自Invitrogen 公司；Q5 High-Fidelity DNA Polymerase、T4 Polynucleotide Kinase、SbfⅠ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase 均購自NEB 公司；DL2000、DL5000 DNA Marker 購自TaKaRa 公司；Plasmid Midi Kit 購自Qiagen 公司；膠回收試劑盒購自O(shè)mega 公司；轉(zhuǎn)染試劑TransIT-X2 Dynamic Delivery System 購自Mirus 公司；DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、病毒DNA 提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 重組質(zhì)粒pENTR-SV40-RFP 的構(gòu)建 根據(jù)RFP 基因(M96064.1)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物RFP-F/R(表1)，本實(shí)驗(yàn)所用引物均由擎科生物技術(shù)有限公司合成。以pDsred2-N1 為模板，采用引物RFP-F/R 擴(kuò)增含有RFP 的目的基因。PCR 反應(yīng)條件為：98 ℃30 s；98 ℃10 s、56 ℃30 s、72 ℃2 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃2 min。膠回收純化后即獲得含有RFP 的目的基因。利用EcoR V 酶切后將其連接至pENTR-SV40 質(zhì)粒中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pENTR-SV40-RFP。以RFP-F/R為引物，通過PCR 和測序鑒定該重組質(zhì)粒。

1.4 重組粘粒pFosD-RFP 的構(gòu)建 以含有CCDB基因的質(zhì)粒為模板，采用引物CCDB-F/R (表1)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件為：98 ℃30 s；98 ℃10 s、56 ℃30 s、72 ℃2 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃2 min。膠回收純化后即得到含有CCDB 的表達(dá)框。參照Gateway 系統(tǒng)的操作說明，先用E/T 克隆將該CCDB表達(dá)框插入到粘粒pFosD 基因組中，插入位點(diǎn)位于DEV 基因組UL 區(qū)的UL44.5 和UL44 的復(fù)制非必需區(qū)之間，得到含有CCDB 的重組粘粒pFosD-CCDB。利用LR 克隆技術(shù)將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pENTRSV40-RFP 與重組粘粒pFosD-CCDB 進(jìn)行反應(yīng)，得到含有RFP 的重組粘粒pFosD-RFP。通過PCR 方法和測序驗(yàn)證重組粘粒pFosD-RFP 的構(gòu)建是否正確。

1.5 重組病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 的拯救及遺傳穩(wěn)定性的鑒定 利用SbfⅠ限制性內(nèi)切酶將pFosT、pFosH、pFosJ、pFosQ 和pFosD-RFP 等5 個(gè)粘粒線性化處理，使用酚-氯仿方法回收酶切后的DNA 產(chǎn)物，參照磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法分別將5 個(gè)線性化粘粒共同轉(zhuǎn)染次代雞胚成纖緯細(xì)胞(CEF)，連續(xù)傳至第10代，并且連續(xù)觀察紅色熒光表達(dá)情況。利用病毒DNA 提取試劑盒分別提取第5 代、10 代重組病毒感染CEF 細(xì)胞的總DNA，采用插入到DEV 基因組兩側(cè)的位點(diǎn)鑒定引物UL44.5-F/UL44-R (表1)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，鑒定重組病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 拯救情況及遺傳穩(wěn)定性。

1.6 重組病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 的生長曲線滴定 將重組病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 和親本DEV 疫苗株以MOI 0.01 的劑量分別接種次代CEF，分別于接種24 h、48 h、72 h、96 h 后收集細(xì)胞和上清，完全凍融一次，充分震蕩混勻后離心，取上清滴加于96 孔板中，待5 d～6 d 后計(jì)算出每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各病毒的TCID50。利用GraphPad 軟件制作重組病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 和野生型DEV 在CEF 中的生長曲線，并對(duì)重組病毒在CEF 中的增殖情況進(jìn)行分析。

表1 引物序列Table1 Primer sequence

1.7 重組病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 免疫效力評(píng)價(jià)將2 周齡SPF 鴨分為3 組，8 只/ 組。第一組以105TCID50/ 只重組病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 進(jìn)行免疫；第二組以105TCID50/只免疫DEV 疫苗株，作為陽性對(duì)照組；第三組免疫PBS (0.2 mL/只)，作為空白對(duì)照組(Mock-Con)。免疫14 d 分別用100LD50的DEV AV1221 株強(qiáng)毒攻擊。攻毒后連續(xù)觀察14 d，記錄各組鴨發(fā)病和死亡情況。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒pENTR-SV40-RFP 的構(gòu)建與鑒定使用引物RFP-F/R 對(duì)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pENTRSV40-RFP 進(jìn)行PCR 鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，經(jīng)擴(kuò)增得到約1 600 bp的目的條帶，大小與預(yù)期相符(圖1)，測序結(jié)果也與預(yù)期相符。表明重組質(zhì)粒pENTR-SV40-RFP 正確構(gòu)建。

圖1 重組質(zhì)粒pENTR-SV40-RFP 的PCR 鑒定Fig.1 Amplification of pENTR-SV40-RFP by PCR

2.2 重組粘粒pFosD-RFP 的構(gòu)建與鑒定 對(duì)構(gòu)建的重組粘粒pFosD-RFP 進(jìn)行PCR 鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，經(jīng)擴(kuò)增得到約1 600 bp 的目的條帶，大小與預(yù)期符(圖2)，測序結(jié)果也與預(yù)期相符。表明重組粘粒pFosD-RFP 正確構(gòu)建。

圖2 重組質(zhì)粒pFosD-RFP 的PCR 鑒定Fig.2 Amplification of pFosD-RFP by PCR

2.3 重組病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 的拯救 將pFosT、pFosH、pFosJ、pFosQ 和pFosD-RFP 5 個(gè)重組粘粒線性化后共轉(zhuǎn)染次代CEF 中5 d 后，利用倒置熒光顯微鏡觀察可見1 代、5 代、10 代重組病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 均有紅色熒光(圖3)，表明獲得遺傳穩(wěn)定的重組病毒rDEV-ul44.5ul44RFP。

圖3 重組病毒熒光表達(dá)情況Fig.3 Identification of recombinant viruses

分別提取第5 和10 代重組病毒細(xì)胞總DNA，利用引物UL44.5-F/UL44-R 經(jīng)插入外源RFP 表達(dá)框的PCR 鑒定，結(jié)果顯示兩個(gè)代次重組病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 泳道均出現(xiàn)特異性的約1 600 bp 的目的條帶，對(duì)照組野生型DEV 中兩位點(diǎn)的泳道出現(xiàn)約300 bp 的條帶(圖4)。表明外源RFP 表達(dá)框插入DEV 基因組的UL44.5 和UL44 之間，并正確表達(dá)且穩(wěn)定存在。

圖4 重組病毒的PCR 鑒定結(jié)果Fig.4 Identification of recombinant viruses by PCR

2.4 重組病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 生長曲線滴定結(jié)果 將rDEV-ul44.5ul44RFP 和DEV 以MOI 0.01的劑量接種CEF，接種后每隔24 h 滴定其TCID50，并繪制其生長曲線。結(jié)果顯示，該重組病毒和親本DEV 在CEF 中的復(fù)制無顯著性差異(圖5)，表明在DEV 基因組UL44.5 和UL44 之間插入外源基因后，外源基因可以正確表達(dá)，且對(duì)重組病毒在細(xì)胞中的生長無明顯影響。

圖5 重組病毒和DEV 在CEF 中的生長曲線Fig.5 Growth curve of the recombinant viruses and DEV in CEF

2.5 重組病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 免疫效力評(píng)價(jià)結(jié)果 將DEV 疫苗株和重組病毒rDEV-ul44.5 ul44RFP 分別以105TCID50免疫SPF 鴨，免疫后2 周利用DEV 強(qiáng)毒攻擊。結(jié)果顯示， DEV 疫苗株、重組病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 均能夠?qū)EV 強(qiáng)毒攻擊的SPF 鴨提供100 %保護(hù)；空白對(duì)照組(Mock-Con)SPF 鴨發(fā)病率死亡率均為100 % (圖6)。表明利用反向遺傳操作技術(shù)構(gòu)建的重組DEV 具有良好的免疫原性，DEV 基因組UL 區(qū)的UL44.5 和UL44 之間可以用作構(gòu)建表達(dá)外源基因重組病毒的理想位點(diǎn)。

圖6 重組病毒免疫后對(duì)DEV 強(qiáng)毒攻毒的保護(hù)效力Fig.6 Protective efficacy of the recombinant viruses against DEV

3 討 論

DEV 弱毒活疫苗自60 年代以來在多個(gè)國家廣泛使用，對(duì)預(yù)防DEV 具有良好的保護(hù)效果。DEV作為理想的重組病毒載體，具有免疫后幾小時(shí)即可產(chǎn)生堅(jiān)實(shí)的免疫保護(hù)，且不受母源抗體的干擾[7]。隨著近些年基因組序列和基因功能研究的不斷深入，以DEV 為載體表達(dá)其它抗原的疫苗研究報(bào)道逐漸增多[8-11]，該策略主要是通過篩選DEV 復(fù)制非必需區(qū)進(jìn)行外源基因的表達(dá)，從而構(gòu)建重組病毒，并通過相關(guān)評(píng)價(jià)確定其作為疫苗候選株的可行性。

相關(guān)研究者將1 型和3 型鴨肝炎病毒表達(dá)VP1蛋白的基因通過2A 序列串聯(lián)后，插入DEV C-KCE株UL27 與UL26 基因之間，構(gòu)建的重組疫苗rC-KCE-2VP1 能夠產(chǎn)生快速的免疫反應(yīng)[12]。Wang 等利用細(xì)菌人工染色體(BAC)技術(shù)，將H5N1 亞型禽流感病毒HA 基因插入DEV C-KCE 株UL55 基因內(nèi)部構(gòu)建得到重組疫苗[13]。胡玉珍等獲得了DEV 兩個(gè)可供外源基因插入的復(fù)制非必需區(qū)，分別位于us7基因內(nèi)部、us8 和us1 基因之間，并構(gòu)建了兩株重組病毒[14]。本研究構(gòu)建了重組病毒rDEV-ul44.5 ul44RFP，病毒經(jīng)過連續(xù)傳代至第10 代，經(jīng)鑒定表明外源基因在該位點(diǎn)可以穩(wěn)定遺傳；表達(dá)的紅色熒光表明，插入的RFP 基因能夠穩(wěn)定表達(dá)；重組病毒在CEF 中的生長曲線顯示，該株重組病毒的生長特性與DEV 疫苗株無顯著差異，說明外源RFP 基因的插入不影響重組病毒的增殖特性。重組病毒rDEV-ul44.5ul44RFP 以105TCID50免疫SPF 鴨，攻毒保護(hù)結(jié)果顯示，SPF 鴨在免疫14 d 后均能夠誘導(dǎo)對(duì)DEV 強(qiáng)毒攻擊的保護(hù)，保護(hù)效率均為100 %。這些結(jié)果表明，UL44.5 和UL44 基因間隔區(qū)是DEV 基因組的一個(gè)復(fù)制非必需區(qū)。鴨瘟病毒UL44 位于鴨瘟病毒基因組UL 區(qū)，其ORF 長1 296 bp，編碼431個(gè)氨基酸的glycoprotein C (gC)。gC 能夠免與補(bǔ)體C3b 受體片斷結(jié)合，參與免疫逃避過程，抑制補(bǔ)體的激活途徑，保護(hù)病毒不被抗體和補(bǔ)體中和。DEV UL44.5 基因的ORF 長813 bp，編碼270 個(gè)氨基酸的蛋白。關(guān)于新位點(diǎn)插入外源RFP 基因是否干擾其兩側(cè)UL44.5、UL44 和病毒其它基因的功能性表達(dá)有待于進(jìn)一步研究。

本研究鑒定出UL44.5 和UL44 基因間隔區(qū)是DEV 基因組的一個(gè)復(fù)制非必需區(qū)，更加完善了DEV 基因組的信息，同時(shí)為利用該位點(diǎn)構(gòu)建以DEV 為載體的疫苗奠定基礎(chǔ)。