夏澳運(yùn)，彭子艾，李丹丹，趙壯壯，王 慧，陳志強(qiáng)，郭 濤

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家植物航天育種工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642）

【研究意義】水稻是世界上最重要的糧食作物之一，其產(chǎn)量占世界糧食總產(chǎn)量的50 %左右，世界上一半以上人口以稻米為主食［1-2］。水稻新品種的選育對(duì)于提升糧食安全水平具有重要意義，而種質(zhì)資源的不斷創(chuàng)新是水稻新品種選育的基礎(chǔ)。近年來，分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)已經(jīng)在水稻抗病及品質(zhì)種質(zhì)創(chuàng)新方面開展了大量研究，顯著提升了水稻新品種選育的效率［3］。此外，誘變育種技術(shù)在豐富種質(zhì)資源、加速育種進(jìn)程方面也起到了重要作用［4］。將分子育種、誘變育種與傳統(tǒng)育種技術(shù)結(jié)合，可以不斷豐富水稻遺傳資源，提升水稻新品種選育效率。對(duì)于分子育種或誘變育種獲得的遺傳分離群體，利用分子標(biāo)記獲取不同個(gè)體的基因型來說，是種質(zhì)資源精確鑒定的強(qiáng)有力手段［5］。

【前人研究進(jìn)展】對(duì)于植物基因分型來說，一般都需要從數(shù)量龐大的遺傳分離群體中進(jìn)行篩選，同時(shí)要實(shí)現(xiàn)單株與DNA樣本一一對(duì)應(yīng)，以便準(zhǔn)確篩選出目標(biāo)植株，而對(duì)某基因的定位也經(jīng)常需要從成千上百份分離群體中提取DNA來篩選目標(biāo)位點(diǎn)，其工作量之大顯而易見［6］。目前，普遍采用的方法是剪取植物的葉片并提取DNA，但面對(duì)大批量樣本采集時(shí)，該方法成本高、效率低且容易出現(xiàn)單株與DNA樣本無法對(duì)應(yīng)的錯(cuò)誤［7］。此外，目前普遍使用的DNA 提取方法為 SDS法或CTAB法，雖然這些方法提取的 DNA 質(zhì)量、產(chǎn)量和純度均較高，但操作步驟多、耗時(shí)長(zhǎng)、成本高，成為限制水稻大規(guī)模基因分型中提高效率和降低成本的關(guān)鍵因素［8-11］。

【本研究切入點(diǎn)】在大規(guī)?；赑CR的基因分型檢測(cè)作業(yè)中，高效、快速、簡(jiǎn)便的模板DNA制備顯得非常重要，針對(duì)目前組織樣本獲取和DNA提取效率低的問題，建立一種適用于高通量基因分型的簡(jiǎn)易、高效和低成本的水稻 DNA 提取方法十分迫切和必要。【擬解決的關(guān)鍵問題】為解決限制水稻DNA高效提取問題，探索快速有效的DNA提取方法，本研究從組織取樣與DNA提取兩個(gè)方面著手，設(shè)計(jì)了一次性可采集96個(gè)水稻植株的根部組織并快速提取DNA的方法，該方法克服了傳統(tǒng)方法的工作量大、效率低的缺點(diǎn)，在水稻育種實(shí)踐中具有較大價(jià)值，為水稻分子育種提供有效的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

器材：水稻種子，96孔深孔板，96孔PCR板，金屬球（d≈0.27 cm），金屬盤（32 cm×22 cm× 3 cm），24微孔板金屬熱塊（QBLock-0.2），高通量組織研磨機(jī)（2010 Genogrinder），玻璃棒（d≈0.35 cm）等。

試劑：干冰，乙醇 （95% V/V），2% CTAB提 取 液，500 mmol/L TRIS（pH=8），50 mmol/L EDTA（pH=9）等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子處理及培養(yǎng) 將水稻種子消毒、浸種、催芽后，挑選胚芽長(zhǎng)2.5 mm左右的種子備用（圖1A）。在96深孔板每個(gè)孔底部鉆出小孔（圖1B），孔徑約3 mm（圖1C）。將萌發(fā)的水稻種子放入96深孔板中，胚向下，每孔1粒種子（圖1D）。深孔板與PCR板上下疊放（圖1E），深孔板在上、PCR板在下，兩者的孔一一對(duì)應(yīng)，即深孔板A1應(yīng)對(duì)應(yīng)PCR板A1孔，用橡皮筋將兩端固定（圖1F）。固定好的裝置稱為雙層生長(zhǎng)板，將生長(zhǎng)板放入金屬托盤中，加入蒸餾水漫過下部PCR板（圖1G），水深約3 cm（圖1H），使PCR板的每個(gè)孔中均充滿蒸餾水。金屬托盤及生長(zhǎng)板（圖1I）放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約9 d，培養(yǎng)條件：12 h光照、12 h黑暗，30 ℃恒溫。培養(yǎng)過程中，注意觀察液面高度，及時(shí)更換補(bǔ)充蒸餾水至3 cm深。

1.2.2 DNA提取及擴(kuò)增 （1）CTAB法提取根部DNA，參考 CHEN等［12］的方法進(jìn)行。（2）磁珠法提取樣本DNA，對(duì)獲取的根部組織進(jìn)行研磨和不研磨兩種處理，參考CHEN等［12］的方法分別提取樣本DNA。（3）改良TRIS-EDTA法提取根部DNA。將 25 μ L TRIS-EDTA（500 mmol/L TRIS，pH=8；50 mmol/L EDTA，pH=9）溶液和根部組織放入含有250 μ L蒸餾水的PCR板孔中密封，組織研磨機(jī)粉碎后，3 600 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行檢測(cè)并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

圖1 水稻種子的處理與幼苗培養(yǎng)Fig.1 Treatment of rice seed treatment and seedling cultivation culture

引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增方法：根據(jù)已報(bào)道的GS3基因第三外顯子（45 bp）序列設(shè)計(jì)引物［13］，引物序列由金唯智公司合成，正向序列：5′-GAACTTCGTCGATTGTGTGG-3′，反向序列：5′-GCTTCTCCGATGAACTGCTT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為250 bp。PCR擴(kuò)增體系為 10 μL：DNA 模板 1 μL；Master Mix 5 μL；引物各 0.2 μL；ddH2O 3.6 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；然后按 95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。取7 μL PCR產(chǎn)物，加入5 μL指示劑，在1%瓊脂糖凝膠中電泳30 min，用凝膠成像儀掃描拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻幼苗根部組織捕獲效率分析

水稻種子培養(yǎng)約9 d后，下部PCR板的孔中存在大量的根，可以進(jìn)行根部組織的捕獲。具體方法如下：（1）從金屬托盤中取出雙層生長(zhǎng)板（圖2A），此時(shí)水稻幼苗已發(fā)育完全（圖2B）。將橡皮筋留在原位，在兩板之間打開一個(gè)間隙，小心地在上下板之間插入玻璃棒，在兩個(gè)板之間形成一個(gè)間隙（圖2C），從孔中可以清晰的觀察到內(nèi)部的根與苗（圖2D）。（2）將4塊24孔金屬熱塊拼在一起放入金屬盤中。小心地將95% （V/V）乙醇與干冰（乙醇500 mL，干冰3 kg）倒入玻璃盤中，直到混合液體的液面恰好低于金屬熱塊的表面。金屬熱塊冷卻約30 min，使溫度達(dá)到平衡（圖2E）。（3）將雙層生長(zhǎng)板放置于金屬熱塊上，下部PCR板插入金屬熱塊對(duì)應(yīng)孔中。雙層生長(zhǎng)板放在金屬熱塊上約6 min，在此期間下部PCR板中的水將冷凍為冰（圖2F）。6 min后將雙層生長(zhǎng)板從金屬熱塊上移出，移除橡皮筋，并從板之間移除玻璃棒。向下按壓上部深孔板，然后小心地分開上部深孔板與下部PCR板，清除下部PCR板表面的殘冰（圖2G）。此時(shí)，下部PCR板的孔中即保留了冷凍后的根部組織（圖2H）。收獲根部組織后，上部幼苗可轉(zhuǎn)移到裝滿水或營(yíng)養(yǎng)液的金屬托盤中，以使幼苗繼續(xù)生長(zhǎng) （圖2I）。利用此方法，成功獲得96個(gè)樣本的根部組織，樣本捕獲的成功率為100%；此外，此方法獲得的根部組織長(zhǎng)度介于2～3 cm，重量約0.03～0.06 g，各樣品組織均勻一致，為DNA提取奠定了良好基礎(chǔ)。與傳統(tǒng)剪取葉片法比較，本方法獲取96個(gè)樣本組織僅耗時(shí)約10 min，而剪取葉片法耗時(shí)約30 min。

2.2 DNA提取結(jié)果分析

圖2 水稻幼根捕獲與DNA提取Fig.2 Rice root capture and DNA extraction

對(duì)獲得的根部樣本，采用4種方法進(jìn)行DNA提取，并比較DNA提取效率。結(jié)果（表1）表明，4種方法均可提取水稻幼苗根部DNA，所獲取的DNA可滿足分子標(biāo)記分析需求。從濃度與質(zhì)量上來看，相比較其他3種方法，使用改良TRISEDTA法提取的 DNA個(gè)體間差異較小，整體濃度較高，濃度平均值為92.54 ng/vL，A260/280平均值為1.74，DNA純度較高；基于磁珠的兩種DNA提取方法，所獲得的DNA濃度差別較大，其中根組織研磨后DNA提取濃度為55.68 ng/μL，顯著高于不研磨的磁珠法。從效率上來看，改良TRIS-EDTA法批量提取DNA的時(shí)間明顯低于其他3種方法，效率最高。此外，TRIS-EDTA法提取DNA的費(fèi)用約為0.1元/樣品，而CTAB法為0.8元/樣品、磁珠法平均為0.5元/樣品?？梢姡琓RIS-EDTA法提取DNA的產(chǎn)量高、效率高、費(fèi)用低，是比較理想的水稻根部DNA提取技術(shù)。

為了比較4種方法提取DNA的PCR擴(kuò)增效果，利用GS3基因引物分別擴(kuò)增4種方法獲得的模板DNA。電泳檢測(cè)結(jié)果（圖3A）表明，4種方法所提取的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物均條帶明亮、清晰，片段大小符合預(yù)期，說明4種方法所提取DNA均可用于分子標(biāo)記分析。改良TRIS-EDTA法提取的基因組DNA在96個(gè)樣本中均可擴(kuò)增出清晰、明亮的目的條帶，具有較高的穩(wěn)定性（圖3B）。

表1 不同提取方法的DNA濃度、質(zhì)量及提取時(shí)間Table 1 DNA concentration, quality and extraction time of different extraction methods

圖3 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.3 Agarose gel electrophoresis results of PCR product

3 討論

隨著越來越多的分子標(biāo)記可供植物育種者使用，迫切需要能對(duì)大量單株進(jìn)行基因分型的高效方法［14-15］。而大量樣本的種植管理、樣本組織的高效獲取及DNA的有效提取是高通量基因分型的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［16-17］。

對(duì)于樣本組織的獲取，目前普遍采用的方法是技術(shù)人員在田間收取植物的葉片或其他組織器官并編號(hào)，但該方法過程煩瑣，成本較高，較易出錯(cuò)，不適于大規(guī)模的樣本收集［18-19］。針對(duì)傳統(tǒng)方法缺點(diǎn)，本研究將水稻種植于96孔板中，實(shí)現(xiàn)根部組織的批量獲取，同時(shí)繼續(xù)保留樣本活體，可以在獲取基因型后把目標(biāo)單株種植到田間。與前人方法相比，本研究的組織獲取方法可顯著降低田間勞作強(qiáng)度，且樣品和DNA可以實(shí)現(xiàn)精確對(duì)應(yīng)，具有高效便捷、省時(shí)省力的優(yōu)點(diǎn)。限制高通量基因分型的另一個(gè)因素是DNA的快速提取，經(jīng)典的CTAB或SDS可獲取高質(zhì)量的DNA，但提取過程煩瑣，成本較高，不適于大規(guī)模的基因型檢測(cè)［10,20］。目前也報(bào)道了各類簡(jiǎn)化DNA提取方法，但是這些方法仍然存在提取效率不高的問題［21-24］，如趙國(guó)珍等［25］的方法提取96個(gè)樣本DNA需耗時(shí)1 h。而本研究改良TRIS-EDTA法批量提取96個(gè)樣本DNA的時(shí)間約為0.3 h，并且DNA質(zhì)量完全滿足分子標(biāo)記需求。此外，改良TRIS-EDTA法提取DNA的費(fèi)用約為0.1元/樣品，而CTAB法為0.8元/樣品?？梢?，本研究開發(fā)的TRIS-EDTA法提取DNA的產(chǎn)量高、效率高、費(fèi)用低，是比較理想的水稻根部DNA提取技術(shù)，非常適合水稻的高通量基因分型。

4 結(jié)論

本研究開發(fā)的水稻根部組織DNA獲取方法（TRIS-EDTA法）克服了傳統(tǒng)水稻DNA樣本獲取工作量大、費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)，可有效服務(wù)于水稻分子育種和突變體基因型篩選。此外，該方法還可用于收集水稻根部組織進(jìn)行代謝組、轉(zhuǎn)錄組或蛋白質(zhì)組的高通量分析，對(duì)于其他作物的DNA高通量提取也具有參考價(jià)值。