王長(zhǎng)偉 李八方 宋文山 劉楚怡 馮曉梅

摘要 [目的]研究牡蠣蛋白肽的制備工藝及其功能活性評(píng)價(jià)。[方法]以新鮮無(wú)殼牡蠣為原料，采用胰酶酶解的方法制備牡蠣活性肽，經(jīng)膜分離后使用HPLC測(cè)定其相對(duì)分子質(zhì)量分布，使用斷乳SD大鼠進(jìn)行促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育功能評(píng)價(jià)。[結(jié)果]得到均分子量為750 Da的活性肽，該活性肽在灌胃給藥劑量為2.0 g/kg（劑量/體重）時(shí)，具有改善大鼠生長(zhǎng)發(fā)育的功能。[結(jié)論]該研究對(duì)牡蠣肽的生產(chǎn)具有一定指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞 牡蠣蛋白肽;制備工藝;生長(zhǎng)發(fā)育;功能活性;SD斷乳大鼠

中圖分類號(hào) TS254.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）17-0161-04

Abstract [Objective] The research aimed to study the preparation process of oyster protein peptide and its functional activity evaluation.[Method]The oyster active peptide was prepared by trypsin enzymatic hydrolysis using fresh oysters without shells as raw material.The oyster protein peptide were separated from the hydrolyzate by membrane， their molecular weight distribution was determined by HPLC， and the function of promoting growth and development was evaluated by SD weaning rats.[Result]The active peptide with average molecular weight of 750 Da was obtained， besides the protein peptide could improve the growth and development of rats at the dose of 2.0 g/kg （dose/body weight）.[Conclusion]The study has certain guiding significance to the production of oyster peptide.

Key words Oyster protein peptide;Preparation process; Growth and development; Functional activity; SD weaning rat

牡蠣味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，歷來(lái)受世人推崇。古人認(rèn)為它是“水產(chǎn)品之最貴者”，古羅馬人把它譽(yù)為“海中美味——圣魚(yú)”，西方人稱之為“神賜魔石”“海中牛奶”，日本人則譽(yù)之為“根之源”[1]。牡蠣肉含有豐富的糖原、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、微量元素和維生素等，其中糖原占18%～39%，蛋白質(zhì)為45%～57%，脂肪為7%～11%。牡蠣氨基酸組成完善，據(jù)世界糧農(nóng)組織評(píng)定，牡蠣肉中必需氨基酸完全程度和質(zhì)量比例優(yōu)于人乳和牛乳[2]，其除了含人體必需的20種常見(jiàn)氨基酸外，還含有β-氨基丙酸、γ-氨基丁酸、鳥(niǎo)氨酸、?；撬岬榷喾N具有重要生理價(jià)值的氨基酸。特別是?；撬岬暮坑绕湄S富，明顯高于其他動(dòng)物性食品[3]，含量可以達(dá)到總氨基酸量的30.98%。

隨著食品、醫(yī)藥、生物技術(shù)的快速發(fā)展和營(yíng)養(yǎng)知識(shí)的普及，以及人均收入水平的增加和消費(fèi)水平的提高，人類對(duì)于食品的要求已經(jīng)從溫飽過(guò)渡到了營(yíng)養(yǎng)水平，天然、健康、營(yíng)養(yǎng)、安全已經(jīng)成為21世紀(jì)食品工業(yè)發(fā)展的主要議題。人類對(duì)牡蠣保健功能的認(rèn)識(shí)已逾千年，早在我國(guó)古代《神農(nóng)本草經(jīng)》《名醫(yī)別錄》《本草綱目》《海藥本草》等醫(yī)療史籍中已經(jīng)有對(duì)于牡蠣藥用價(jià)值的記載。牡蠣又是中國(guó)衛(wèi)生部公布的第一批68種藥食同源的食品之一[4]。目前，運(yùn)用現(xiàn)代科技手段，牡蠣資源在普通食品、保健食品、功能食品、醫(yī)藥、化學(xué)化工等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。近年來(lái)，不少學(xué)者報(bào)道了牡蠣提取物具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗疲勞、抗氧化、降血壓、降血糖等重要的生理功能，在我國(guó)醫(yī)學(xué)界得到廣泛的認(rèn)可和應(yīng)用[5-10]，但對(duì)牡蠣肽的促生長(zhǎng)發(fā)育作用仍鮮有報(bào)道。筆者采用新鮮去殼牡蠣為原料，使用胰酶酶解，分離后得到牡蠣功能活性肽，使用HPLC測(cè)定功能蛋白肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布，并使用SD斷乳大鼠進(jìn)行其促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育功能評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及主要設(shè)備 新鮮去殼牡蠣，市售;胰酶，廣西龐博生物有限公司;SPF級(jí)SD斷乳大鼠，濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司;其他試劑均為分析純。恒溫振蕩器（常州國(guó)華電器有限公司）;pH計(jì)（安萊立思儀器科技有限公司）;分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）;勻漿機(jī)（上海那艾精密儀器有限公司）;高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）;液相實(shí)驗(yàn)室用膜分離設(shè)備（上海摩速科學(xué)器材有限公司）;高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 牡蠣肽制備的單因素試驗(yàn)。

牡蠣肉洗凈瀝干水分，勻漿后加入一定比例的水，加胰蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解完成后，將酶解液加熱至90～100 ℃滅酶10～15 min，然后將其離心（10 000 r/min）10 min得上清液，測(cè)定水解度（DH），根據(jù)水解度大小確定最佳酶解條件。

DH=hhtot×100%=[水解液NH2的含量（μmol/mL）6.25 N（mg/mL）-原料蛋白質(zhì)中游離NH2含量（mmol/g）]/htot×100%

式中，DH為水解度（%）;h為水解后每克蛋白質(zhì)被裂解的肽鍵毫摩爾數(shù)（mmol/g）;htot為每克原料蛋白質(zhì)的肽鍵毫摩爾數(shù)（mmol/g），牡蠣蛋白肽取 8.0。

1.2.2 牡蠣肽制備的響應(yīng)面試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果使用響應(yīng)面設(shè)計(jì)軟件Design-Expert 8.0.6進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，固定料液比1∶1、水解時(shí)間4 h，對(duì)不同溫度、不同pH及加酶量進(jìn)行優(yōu)化，共設(shè)計(jì)17個(gè)反應(yīng)。酶解后將酶解液加熱至90～100 ℃滅酶10～15 min，然后將其離心（10 000 r/min）10 min得上清液，測(cè)定水解度（DH），根據(jù)水解度大小確定最佳酶解條件。

1.2.3 牡蠣蛋白肽的分離純化。通過(guò)離心分離、粗濾、超濾等步驟去除異味以及大分子蛋白，通過(guò)納濾去除部分鹽分并進(jìn)行濃縮，冷凍干燥后分析其質(zhì)量并進(jìn)行動(dòng)物活性試驗(yàn)。

1.2.4 分子量測(cè)定。

柱溫30 ℃，體積流量為0.8 mL/min下使用TSKgel G2000 SWXL 300 mm×7.8 mm（GEL LOT 502R）色譜柱，在檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm下測(cè)定，其中流動(dòng)相為乙腈∶0.05%三氟乙酸，體積比為30∶70。

1.2.5 牡蠣肽功能活性的測(cè)定。

選用斷乳SD大鼠，4周齡，試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)體重為50～80 g。試驗(yàn)分組及受試樣品給予時(shí)間：分別設(shè)3個(gè)劑量組——低劑量組（0.5 g/kg）、中劑量組（1.0 g/kg）、高劑量組（2.0 g/kg），另外設(shè)一個(gè)正常對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)大鼠除每天給予基礎(chǔ)飼料和水外，每天灌胃受試樣品一次（正常對(duì)照組灌胃生理鹽水），受試樣品給予時(shí)間為42 d。給藥期間每周檢測(cè)大鼠2次體重，觀察記錄其體重變化情況。

試驗(yàn)結(jié)束后，檢測(cè)試驗(yàn)動(dòng)物的體重、鼻肛長(zhǎng)、鼻尾長(zhǎng)、脛骨長(zhǎng)度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果用平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差表示（Mean±SD）。SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05組間差異顯著，P>0.05無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。給藥組身長(zhǎng)高于正常對(duì)照組，且差異有顯著性，食物利用率不明顯低于正常對(duì)照組，可判定該受試樣品改善生長(zhǎng)發(fā)育動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡蠣肽制備的單因素試驗(yàn)

由單因素試驗(yàn)結(jié)果（圖1～4）可知，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度越來(lái)越大，但在4 h時(shí)趨于平緩;不同的pH水解度大小不一樣，在酸性條件下，水解度很小，中性條件下，水解度加大，但也未達(dá)到最大，只有pH為8時(shí)水解度達(dá)最大，這與胰酶酶活的最適pH是一致的，堿性條件增大的情況下，水解度又隨之降低;相同條件下，隨著加酶量的增加，水解度也增加，但在3 000 U/g時(shí)又趨于平緩;水解溫度從30 ℃開(kāi)始，隨著溫度的升高水解度增大，到50 ℃時(shí)水解度最大，超過(guò)50 ℃隨著溫度的增加，水解度又降低，這與胰酶酶活的最適溫度也是一致的;通過(guò)對(duì)不同固液比的酶解液水解度大小測(cè)定得知，固液比越高，水解度越大。

2.2 牡蠣肽制備的響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 反應(yīng)溫度和pH對(duì)水解度的影響。把加酶量固定為0水平，可得到反應(yīng)溫度和pH的交互模型，如圖5所示。

由圖5可知，當(dāng)反應(yīng)溫度過(guò)高或過(guò)低時(shí)，水解度均比較低，只有當(dāng)反應(yīng)溫度取值適中時(shí)，在同一pH條件下，水解度達(dá)最大;同樣，pH過(guò)高或過(guò)低時(shí)，水解度均較低，只有取某一適中值時(shí)，在同一反應(yīng)溫度下，水解度最大。

2.2.2 反應(yīng)溫度和加酶量對(duì)水解度的影響。把pH固定為0水平， 可得到反應(yīng)溫度和加酶量的交互模型，如圖6所示。由圖6可知，當(dāng)固定反應(yīng)溫度為某一值時(shí)，隨著加酶量的增加，水解度逐漸增大，但到一定量時(shí)，增加緩慢;而固定某一加酶量時(shí)，水解溫度過(guò)高或過(guò)低，水解度均偏低，只有溫度取某一最適值時(shí)，水解度最大。

2.2.3 加酶量和pH對(duì)水解度的影響。

把反應(yīng)溫度固定為0水平，可得到加酶量和pH的交互模型，如圖7所示。

由圖7可知，固定某一pH，隨著加酶量的增加，水解度也在加大，但到一定量時(shí)，水解度增加緩慢;固定某一加酶量，pH過(guò)高或過(guò)低，水解度均較低，只有pH取某一合適值時(shí)，水解度最大。

通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)，得到胰酶酶解牡蠣液的最佳條件為溫度51.10 ℃、pH 8.23、加酶量3 750 U/g、水解時(shí)間4 h，該條件下水解度最大，為36.4%。這一結(jié)果與單因素試驗(yàn)結(jié)果是相吻合的。

2.3 牡蠣蛋白肽的分離純化

牡蠣蛋白肽制備工藝路線為

酶解—滅酶—離心（10 000 r/min，10 min，2次）—濾膜過(guò)濾（0.45 μm）—超濾（截留分子量為10 K超濾膜）—納濾（脫鹽，截留分子量150～300 Da）—濃縮凍干。納濾時(shí)，當(dāng)溶液剩余原溶液的一半體積時(shí)，再補(bǔ)充一半體積繼續(xù)納濾，如此反復(fù)進(jìn)行，使用電導(dǎo)率儀對(duì)納濾液及濾出液進(jìn)行測(cè)定，當(dāng)最終納濾液電導(dǎo)率約為500 μs/cm時(shí)，停止納濾，將濃縮液進(jìn)行凍干，最終測(cè)得脫鹽率在26%～35%。

2.4 分子量測(cè)定

對(duì)最佳酶解條件下得到的牡蠣肽進(jìn)行分離純化，脫鹽后得到的產(chǎn)物進(jìn)行分子量測(cè)定，結(jié)果如圖8所示，均分子量為750 Da。

2.5 牡蠣肽功能活性測(cè)定

2.5.1 SD大鼠日均采食量的變化。由表1可見(jiàn)，各劑量組SD大鼠的日均采食量與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），食物利用率無(wú)顯著性差異。

2.5.2 牡蠣蛋白肽對(duì)SD大鼠體重變化的影響。

由表2可知，低、中劑量組SD大鼠的初始體重、試驗(yàn)終期體重與對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;高劑量組SD大鼠的初始體重與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但試驗(yàn)終期體重與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05）。

2.5.3 牡蠣蛋白肽對(duì)SD大鼠鼻肛長(zhǎng)、鼻尾長(zhǎng)、脛骨長(zhǎng)度的影響。

由表3可知，低、中劑量組SD大鼠的鼻肛長(zhǎng)、鼻尾長(zhǎng)、脛骨長(zhǎng)度與對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;高劑量組SD大鼠的脛骨長(zhǎng)度與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但鼻肛長(zhǎng)、鼻尾長(zhǎng)與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05）。

因此可以判定，42 d給藥結(jié)束后牡蠣肽高劑量組體重與對(duì)照組差異顯著（P<0.05），鼻肛長(zhǎng)、鼻尾長(zhǎng)大于對(duì)照組且差異顯著（P<0.05）。日均采食量與對(duì)照組比較差異不顯著（P>0.05）。由此判定該試驗(yàn)制備的牡蠣蛋白肽在灌胃給藥劑量為2.0 g/kg時(shí)，具有改善大鼠生長(zhǎng)發(fā)育的功能。

3 結(jié)論

使用胰酶水解新鮮無(wú)殼牡蠣制備所得的蛋白肽，經(jīng)離心、膜分離純化后得到了均分子量為750 Da的活性肽。經(jīng)SD斷乳大鼠喂養(yǎng)42 d后，灌胃給藥劑量為2.0 g/kg時(shí)，具有顯著改善大鼠生長(zhǎng)發(fā)育的功能。該研究成果對(duì)于牡蠣肽的生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。

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