陳明棠　李輝　黃健　譚正準(zhǔn)　趙朝步　鐘華配　曾詠芳

摘要 為了縮短奶水牛的產(chǎn)犢間隔，提高繁殖效率和養(yǎng)殖效益，利用酶聯(lián)免疫反應(yīng)原理采用一種快速可視孕檢試劑盒對配種后28 d以上的試驗?zāi)概＿M(jìn)行檢測。對429例已配種母牛進(jìn)行檢測，其中陰性（空懷）265例，陽性（懷孕）164例，驗證檢查陰性265例，陽性160例，試劑盒檢測的陰性準(zhǔn)確率為100%，陽性準(zhǔn)確率為97.56%，可見該試劑盒可用于水牛的早期孕檢。

關(guān)鍵詞 奶水牛;早期孕檢;酶聯(lián)免疫反應(yīng)試劑盒;產(chǎn)犢間隔

中圖分類號 S823.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）17-0098-02

Abstract In order to shorten the calving interval of dairy buffalo and improve the efficiency of breeding and raising efficiency，we used enzymelinked immune reaction principle， adopted a quick and visual pregnancy test kit to make early pregnancy test on experimental cows more than 28 days after mating. 429 cases of mated cows were detected， the results showed that 265 cows were negative （empty），164 cows were positive （pregnant）， and 265 cows were negative by validation check and 160 cows were positive by validation check. The negative accuracy was 100% and? the positive accuracy was 97.56% by ELISA kit. Therefore， this kit was suitable for early pregnancy test of buffalo.

Key words Dairy buffalo;Early pregnancy test;ELISA kit;Calving interval

及早對配種母牛進(jìn)行準(zhǔn)確的懷孕檢查，可以查找出尚未懷孕的牛，方便觀察和重配空懷奶牛，以縮短產(chǎn)犢間隔、減少無效飼養(yǎng)，從而提高養(yǎng)殖效益。國內(nèi)外開展的早期妊娠診斷研究很多，主要包括外部觀察法、直腸檢查法、超聲波掃描和實驗室檢查（陰道黏液、尿液、乳汁、血液）等，其中直腸觸診和B超診斷在生產(chǎn)上應(yīng)用較多，而實驗室檢查方法比較繁瑣，準(zhǔn)確性也偏低，在生產(chǎn)上應(yīng)用較少。在實驗室檢測方面，Butler等[1]從牛胎盤提取物中首次發(fā)現(xiàn)妊娠特異性蛋白質(zhì)B（pregnancy specific protein B，PSP-B）;Zoli等[2]采用相同方法從牛胎盤組織中完全分離出妊娠相關(guān)糖蛋白（pregnancyassociated glycoprotein，PAG），后來證實PAG即為PSP-B。此后，人們對PAG的分子結(jié)構(gòu)和作用機制進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)PAG主要來源于胎盤，是胎盤功能的標(biāo)志，并在妊娠過程中起著免疫保護(hù)作用，它可以進(jìn)入母體的外周血液循環(huán)，為早期妊娠診斷開辟新的途徑并進(jìn)行商業(yè)開發(fā)?！癐DEXX”（愛德士）?？焖倏梢曉袡z試劑盒通過檢測外周血液中PAG，配種后28 d就可以判斷牛是否懷孕。筆者利用酶聯(lián)免疫反應(yīng)原理采用一種快速可視孕檢試劑盒對配種后28 d以上的試驗?zāi)概＿M(jìn)行了檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗地點 試驗在廣西6個奶水場和1個奶水牛養(yǎng)殖大縣進(jìn)行。

1.2 試驗對象與試劑

試驗對象為產(chǎn)后60 d 以上且配種28 d 以上的奶水牛，檢測的水牛品種包括摩拉水牛、尼里/拉菲水牛、地中海水牛3種河流型水牛以及3個品種與我國沼澤型水牛雜交的后代。

檢測物為全血或血清，試劑為中美合作北京愛德士元享生物科技有限公司提供的“IDEXX”牛快速可視孕檢試劑盒。

檢測前所有的試劑盒組分從冷藏狀態(tài)下復(fù)溫至18～26 ℃。將試劑輕輕旋轉(zhuǎn)，使其混合均勻，檢測不同樣品時需要更換吸頭。

試驗牛頸部或尾根靜脈采血3～5 mL，使用血清時 3 500 r/min離心4 min后，分離血清。

1.3 檢測方法 ①用移液器分別吸取100 μL的陰性對照和陽性對照加入到標(biāo)記好的反應(yīng)孔中。

②逐頭吸取等量被檢樣品加入到不同的反應(yīng)孔中。

③在每個反應(yīng)孔中加入3滴試劑1（檢測溶液）。

④蓋上蓋板，輕彈微量反應(yīng)板10次加以混勻，18～26 ℃下孵育7 min。

⑤孵育完成后，移除板蓋，快速翻轉(zhuǎn)反應(yīng)板，將板孔內(nèi)液體放入廢液缸（或水槽）并用力甩板，使板孔內(nèi)液體流出。

⑥將每個反應(yīng)孔加滿雙蒸水或去離子水，進(jìn)行徹底洗板，確保每個反應(yīng)孔能被徹底清洗，并保證洗液充滿每一個反應(yīng)孔。每次洗板后快速翻轉(zhuǎn)反應(yīng)板，棄去洗液，重復(fù)2次。在最后一次甩板后，將反應(yīng)板用力在吸水紙上拍干，確保每一個反應(yīng)孔中沒有殘留的洗液并清除氣泡。

⑦在每個反應(yīng)孔中加入3滴試劑2（酶標(biāo)抗體），蓋上蓋板，輕彈微量反應(yīng)板10次使其混勻，在18～26 ℃下孵育7 min。

⑧重復(fù)步驟⑤和⑥。

⑨在每個反應(yīng)孔加入3滴試劑3（TMB底物溶液），蓋上蓋板，輕彈微量反應(yīng)板10次使其混勻，在18～26 ℃下孵育7 min。

⑩在每個反應(yīng)孔中加入3滴試劑4（終止液），輕彈微量反應(yīng)板10次使其混勻。

B11將反應(yīng)板放在一張白紙上，肉眼進(jìn)行讀板。

1.4 結(jié)果判定

①空懷。樣品反應(yīng)孔中呈現(xiàn)的顏色比陰性對照孔淺或相同，則判定該動物為空懷。

②懷孕。樣品反應(yīng)孔中呈現(xiàn)藍(lán)色且比陰性對照孔深，則判定該動物懷孕。

③可疑。如果樣品孔顏色很難用肉眼分辨，則被認(rèn)為可疑，需重新采樣復(fù)檢。如果陽性對照孔沒有變藍(lán)，則該試驗結(jié)果無效，需要重做。

1.5 驗證復(fù)檢

配種后45～60 d通過直腸觸檢或B超檢查驗證試劑盒的檢測結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

試驗檢測總頭數(shù)為429頭，其中孕檢試劑盒檢測陰性265頭，陽性164頭;以直腸觸檢或B超檢查進(jìn)行驗證檢測陰性265頭，陽性160頭。以驗證檢測準(zhǔn)確率為100%來計算孕檢試劑盒檢測的準(zhǔn)確率，則孕檢試劑盒檢測陰性準(zhǔn)確率為100%，陽性準(zhǔn)確率為97.56%（表1），與連曉春等[3]、張紅英[4]、溫富勇等[5]使用該試劑盒檢測奶牛的結(jié)果基本一致。

3 討論

（1）IDEXX牛快速可視孕檢試劑盒用于不同品種奶水牛的孕檢，陰性準(zhǔn)確率為100%，陽性準(zhǔn)確率為97.56%，說明該產(chǎn)品適用于水牛的早期孕檢，不同品種間差異不顯著（P>0.05）。

（2） LedezmaTorres等[6]報道，可將配種后第21天綿羊血漿中PAG濃度是否高于l ng/mL作為判定是否妊娠的依據(jù)，第21天判定懷孕準(zhǔn)確率為100%，判定未孕準(zhǔn)確率為98.7%。呂蓮[7]運用半定量PCR技術(shù)和mRNA差異顯示技術(shù)研究了以奶牛血液中PAG基因的表達(dá)量為依據(jù)的早期妊娠診斷方法以及空懷牛和妊娠牛血液相關(guān)基因表達(dá)的差異，結(jié)果顯示空懷牛和懷孕21 d的妊娠牛血液中PAG基因均有表達(dá)，后者PAG基因表達(dá)量略高于前者，但二者差異不顯著，說明配種后21 d奶牛血液中PAG基因的表達(dá)量不能被作為妊娠早期診斷的依據(jù)。IDEXX?？焖倏梢曉袡z檢測試劑盒是根據(jù)酶聯(lián)免疫反應(yīng)原理設(shè)計的，推薦檢測對象為產(chǎn)后60 d且配種28 d以上的母牛，以避免出現(xiàn)假陽性。奶牛妊娠30 d內(nèi)的胚胎死亡率可達(dá)38%[8]，胚胎早期死亡數(shù)約為配種數(shù)的8.89%[9]，PAG的半衰期約為9 d[10]，在胚胎死亡早期PAG會在母牛體內(nèi)循環(huán)，因此使用IDEXX牛快速可視孕檢檢測試劑盒檢測出現(xiàn)一定比例的假陽性屬于正?，F(xiàn)象，處理方法是在一段時間后重新采樣進(jìn)行懷孕復(fù)檢，也可采用其他懷孕檢測方法確認(rèn)。

（3）該產(chǎn)品在技術(shù)層面上是可行的，檢測結(jié)果也是可靠的，但每頭約40元的檢測成本略貴，而且批次頭數(shù)越少，檢測成本越高（每批次需耗費4個對照反應(yīng)孔）。與B超檢查法相比，技術(shù)熟練的檢測人員使用B超檢測法也可在母牛配種后第二情期來臨之前（配種后35～40 d）對配孕情況進(jìn)行確診，2種檢測方法均不影響對第二情期的觀察和配種，但B超的檢測成本更低。與直腸檢查法相比，如果技術(shù)人員熟練掌握直腸檢查法，則檢查成本幾乎可以忽略不計，但其缺點是從配種到確定懷孕的時間稍長，比前2種方法要多損失1 個情期（21 d），不利于成本控制和效益提升。對于規(guī)?；龆裕绻捎弥蹦c檢查法進(jìn)行孕檢，存在每頭母牛21 d的無效飼養(yǎng)和繁殖率降低的風(fēng)險，因此IDEXX?？焖倏梢曉袡z試劑盒具有較大的推廣應(yīng)用前景。目前市售商品對原產(chǎn)品進(jìn)行了優(yōu)化，孵育時間從原來的30 min 縮短到7 min，洗滌液也可用飲用純凈水代替，省去了配液環(huán)節(jié)，操作更為簡便，有利于產(chǎn)品在基層的推廣應(yīng)用。

4 結(jié)論

IDEXX?？焖倏梢曉袡z試劑盒在奶水牛的早期孕檢中，陰性準(zhǔn)確率為100%，陽性準(zhǔn)確率為97.56%。該方法準(zhǔn)確率高，懷孕確診時間早，操作較為簡便，可在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。

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