孫 申 黃紹強(qiáng) 田復(fù)波 袁紅斌

(1海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院麻醉科 上海 200003; 2復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院麻醉科 上海 200090)

子癇前期孕婦往往伴隨嚴(yán)重的全身炎癥反應(yīng)[1],炎癥反應(yīng)也是孕婦發(fā)生一系列病理生理改變的重要原因之一。內(nèi)皮細(xì)胞糖萼(glycocalyx)是血管內(nèi)皮細(xì)胞頂膜的薄分子層,也是一種圍術(shù)期生物標(biāo)志物,可以調(diào)節(jié)血管通透性、介導(dǎo)剪切力反應(yīng)、維持血管功能穩(wěn)態(tài),也可用于評價(jià)患者圍術(shù)期的循環(huán)狀況及預(yù)后。糖萼的破壞與機(jī)體的炎癥反應(yīng)、凝血功能異常、缺血再灌注等有關(guān),會進(jìn)一步加重機(jī)體的炎癥瀑布反應(yīng)和凝血功能障礙,從而形成惡性循環(huán)[2]。糖萼的破壞可以通過血液中糖萼組成成分黏結(jié)蛋白聚糖-1(syndecan-1)和硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)的水平變化來判斷。炎性介質(zhì)表達(dá)上調(diào)可能會導(dǎo)致子癇前期孕婦血液中的syndecan-1水平較普通孕婦或非孕婦女明顯增加[3-4]。

研究證實(shí)增強(qiáng)迷走神經(jīng)活性的膽堿能抗炎通路可能會減緩子癇前期的進(jìn)展,而胸段硬膜外阻滯可以通過膽堿能抗炎通路抑制全身炎癥反應(yīng)[5-6],但椎管內(nèi)阻滯對子癇前期孕婦的炎癥反應(yīng)和糖萼的影響尚不清楚。本研究擬探討椎管內(nèi)阻滯對子癇前期孕鼠的圍產(chǎn)期炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞糖萼脫落及分娩結(jié)局的影響。

材料和方法

交配及建模選擇8～12周齡SPF級SD雌性大鼠20只(上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司)。將雌鼠與雄鼠按1:1的比例合籠,發(fā)現(xiàn)雌鼠陰栓記為妊娠第1天并編號,持續(xù)觀察腹部膨隆確定為妊娠。

大鼠妊娠第13天尾靜脈抽血3～5 mL[7],室溫下靜置30 min,1 000×g離心10 min,取上清,分裝,置于-80 ℃冰箱保存。使用ELISA法檢測血清中syndecan-1、HS、高遷移率族蛋白(high mobility group box-1,HMGB-1)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)水平,試劑盒型號分別為JL20972、JL47241、JL13892(上海江萊生物科技有限公司)和70-EK3822/2 (杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行,每個樣本設(shè)置3個重復(fù)孔,以減少操作誤差。測定450 nm處吸光度(D)值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算每個樣本的syndecan-1、HS、HMGB-1和TNF-α水平。

采用ALC-NIBP無創(chuàng)血壓測量分析系統(tǒng)(上海奧爾科特生物科技有限公司)測量收縮壓(systolic blood pressure,SBP),并采用LH750全自動血液分析儀(美國Beckman-Coulter公司)定量檢測24 h尿蛋白。將極低劑量內(nèi)毒素(l.0 μg/kg,批號:E8029-1VL,西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司)用生理鹽水稀釋至2 mL,在大鼠妊娠第14天使用微量注射泵由尾靜脈緩慢泵入,建立子癇前期孕鼠的動物模型[8-9]。

分組及處理將注射內(nèi)毒素的孕鼠隨機(jī)分為2組(每組10只):生理鹽水組(N組)和鞘內(nèi)置管組(I組)。第15天上午對所有孕鼠進(jìn)行SBP和尿蛋白的檢測。第15天下午對N組孕鼠皮下注射200 μL生理鹽水,至妊娠第19天,每天下午1次,共5次;對I組孕鼠腹腔注射10%水合氯醛(100 mg/kg),麻醉后進(jìn)行鞘內(nèi)置管。將麻醉后的I組孕鼠取俯臥位,于背部正中線L4～5間隙處做一長約2 cm的皮膚縱切口,暴露L4～5棘突間隙并切除部分L4、L5棘突,形成V形切口后進(jìn)一步暴露黃韌帶,用7號針頭穿破黃韌帶及硬脊膜,以鼠尾突然出現(xiàn)側(cè)擺或后腿抽動為成功標(biāo)志。經(jīng)硬脊膜破口向尾側(cè)插入大鼠鞘內(nèi)專用導(dǎo)管(Rat Intrathecal Catheter,批號:0007741,上海玉研科學(xué)儀器有限公司),此時可見導(dǎo)管內(nèi)充盈清亮的腦脊液[10-11]。蛛網(wǎng)膜下腔置管成功后,固定并縫扎導(dǎo)管,以防脫落。用0.9%生理鹽水10 μL沖洗導(dǎo)管,防止血栓堵塞。將導(dǎo)管埋于皮下,縫合切口。術(shù)畢肌注青霉素鈉,臺燈照射保溫1～2 h。待置管孕鼠清醒后,檢查活動情況,有肢體運(yùn)動障礙的孕鼠被剔除出組。經(jīng)鞘內(nèi)導(dǎo)管注入0.75%布比卡因40 μL(批號:B5274,西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司),并用10 μL生理鹽水沖洗導(dǎo)管[10,12-14]。鞘內(nèi)給藥每8 h重復(fù)一次,直至仔鼠娩出。妊娠第16天和第19天,抽血并使用ELISA法檢測血清中syndecan-1、HS、HMGB-1和TNF-α水平。妊娠第19天同時測量SBP和24 h尿蛋白。妊娠第21天,對未自然分娩的大鼠行剖宮產(chǎn),觀察并記錄仔鼠體質(zhì)量和畸形的比例。

I組中1只孕鼠在鞘內(nèi)注射布比卡因后死亡,其余19只孕鼠納入研究。孕鼠體質(zhì)量的組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

血清糖萼標(biāo)志物水平的變化ELISA測定血清糖萼標(biāo)志物水平,第13天syndecan-1和HS水平的組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1A、1B)。第16 天和第19 天,N組syndecan-1水平顯著高于I組(P<0.001,P=0.001),N組的HS水平顯著高于I組(P<0.001,P=0.001)。兩組syndecan-1水平隨時間逐漸增加:N組,P<0.001,P=0.001和0.001;I組:P=0.015、0.001和0.001(圖1A)。第16 天和第19 天,N組HS水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,均顯著高于第13天(P=0.014和0.006),I組HS水平在各時間點(diǎn)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1B)。這一結(jié)果提示血清糖萼標(biāo)志物水平在組內(nèi)和組間有顯著差異。

血清炎癥因子水平的變化ELISA測定血清炎癥因子水平,第13天HMGB-1和TNF-α水平的組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1C、1D)。第16天和第19天N組HMGB-1水平顯著高于I組(P<0.001,P=0.001,圖1C),N組TNF-α水平顯著高于I組(P=0.025和0.006,圖1D)。第16天和第19天2組HMGB-1水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且均顯著高于第13 天(P<0.001,P=0.001;P<0.001,P=0.001)(圖1C)。第16天和第19天N組TNF-α水平顯著高于第13 天(P<0.001,P=0.001)(圖1D),I組的TNF-α水平在各時間點(diǎn)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1D)。這一結(jié)果提示血清炎癥因子水平在組內(nèi)和組間有顯著差異。

SBP和24 h尿蛋白檢測第13天和第15天兩組間SBP水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1E),第19天N組SBP水平顯著高于I組(P<0.001);第15天和第19天N組SBP水平顯著高于第13天(P<0.001,P=0.001),第15天和第19天N組SBP水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第15天I組SBP水平顯著高于第13天和第19天(P<0.001,P=0.001),第13天和第19天N組SBP水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各時間點(diǎn)組間尿蛋白水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1F)。第15天和第19天N組尿蛋白水平均顯著高于第13天(P=0.002,P=0.005),第15天和第19天N組尿蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第15天I組尿蛋白水平均顯著高于第13天(P=0.003),第19天與第13天及第15天的尿蛋白水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一結(jié)果提示SBP水平在組內(nèi)和組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而24 h尿蛋白水平只在組內(nèi)有顯著差異。

分娩結(jié)局N組順產(chǎn)率顯著低于I組(P=0.018,表1),2組剖宮產(chǎn)率和流產(chǎn)率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,N組異常仔鼠發(fā)生率顯著高于I組(P<0.001),N組仔鼠體質(zhì)量顯著低于I組(P<0.001)。這一結(jié)果提示I組的分娩結(jié)局優(yōu)于N組。

Group N:Normal saline group;Group I:Intrathecal tube group.(1)One samplettest,P<0.05,(2)Repeated measures one-way ANOVA,P<0.017.
圖1 子癇前期孕鼠的糖萼標(biāo)志物、炎癥因子、SBP和24 h尿蛋白水平
Fig 1 The level of endothelial glycocalyx,inflammatory factors,SBP and proteinuria for 24 h in pregnant mice with preeclampsia

表1 兩組孕鼠的分娩結(jié)局Tab 1 The obstetric consequences in two groups

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)子癇前期孕鼠的血清糖萼標(biāo)志物syndecan-1水平隨產(chǎn)程進(jìn)展逐漸升高,另一糖萼標(biāo)志物HS水平在子癇前期高于非子癇前期,而椎管內(nèi)阻滯可以減輕糖萼脫落,延緩血清糖萼水平的升高。子癇前期的炎癥因子HMGB-1、TNF-α及SBP、24 h尿蛋白水平均高于非子癇前期,椎管內(nèi)阻滯可以減輕子癇前期孕鼠的HMGB-1、TNF-α和SBP水平的升高。椎管內(nèi)阻滯組孕鼠的分娩結(jié)局優(yōu)于對照組。本研究中子癇前期孕鼠和椎管內(nèi)阻滯孕鼠兩個動物模型的建立借鑒了以往研究的經(jīng)驗(yàn)[8-14],SBP和24 h尿蛋白水平的變化證實(shí)兩個動物模型建模成功。

子癇前期的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,炎癥細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、凝血系統(tǒng)均參與子癇前期的病理生理過程,但各因素間的相互作用尚不清楚[2]。糖萼與這些因素均有關(guān)聯(lián),有研究認(rèn)為胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞syndecan-1表達(dá)減少可能是子癇前期的發(fā)病機(jī)制之一[15]。從以往研究和本研究的結(jié)果看,普通孕婦及子癇前期孕婦的炎癥因子與糖萼水平的變化存在一致性[3-4],但二者之間相互作用的具體機(jī)制尚不清楚。糖萼分子可能通過自身分子胞外段的蛋白聚糖和抗凝血酶Ⅲ結(jié)合,參與抗凝血的過程。子癇前期孕婦體內(nèi)糖萼表達(dá)降低,與抗凝血酶Ⅲ分子的結(jié)合減少,激活的抗凝血酶Ⅲ減少,抗凝血作用減弱,凝血系統(tǒng)失衡,血液呈高凝狀態(tài)[15-16],導(dǎo)致子癇前期的發(fā)生。機(jī)體的炎癥反應(yīng)、凝血功能異常都會導(dǎo)致糖萼的破壞,而糖萼的破壞又會進(jìn)一步加重機(jī)體的炎癥瀑布反應(yīng)和凝血功能障礙,從而形成惡性循環(huán),最終可能影響孕婦的分娩結(jié)局。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是子癇前期的主要病理生理基礎(chǔ),血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、胎盤來源生長因子(placental growth factor,PIGF)、可溶性VEGF受體1(sFlt-1)等是預(yù)測子癇前期的重要標(biāo)記物[17]。而本研究關(guān)注的糖萼有可能成為將來預(yù)測子癇前期的新標(biāo)志物[18]。糖萼在子癇前期發(fā)病機(jī)制中的作用值得深入研究。

研究證實(shí)交感神經(jīng)系統(tǒng)的紊亂會加重糖萼的損傷[5,19],而阻斷交感神經(jīng)會減少糖萼的脫落[20]。也有研究認(rèn)為通過抑制交感神經(jīng)活性,興奮膽堿能抗炎通路,可以延緩子癇前期進(jìn)展[5,21-22]。椎管內(nèi)阻滯同樣有抑制交感神經(jīng)活性的作用,其減弱子癇前期產(chǎn)婦的糖萼損傷、炎癥反應(yīng)及改善分娩結(jié)局的機(jī)制是否和膽堿能抗炎通路有關(guān),有待于進(jìn)一步研究。

本研究中椎管內(nèi)阻滯降低子癇前期孕鼠的SBP水平,這與臨床上子癇前期產(chǎn)婦行椎管內(nèi)分娩鎮(zhèn)痛后血壓下降是一致的,這證明椎管內(nèi)阻滯有利于穩(wěn)定子癇前期產(chǎn)婦的血流動力學(xué),減少心腦血管意外。本研究中椎管內(nèi)阻滯可以改善孕鼠的分娩結(jié)局,這可能與椎管內(nèi)阻滯降低SBP、保護(hù)糖萼及抗炎作用有關(guān)。值得注意的是,本研究中的椎管內(nèi)給藥方式、濃度和劑量與臨床上進(jìn)行椎管內(nèi)分娩鎮(zhèn)痛的方法有一定的差異。這是由于本研究的設(shè)計(jì)并不僅是為了模擬臨床上的椎管內(nèi)分娩鎮(zhèn)痛,而是為了模擬子癇前期的產(chǎn)婦使用椎管內(nèi)阻滯早期干預(yù),留置導(dǎo)管后持續(xù)給藥,以期改善分娩結(jié)局。本研究的結(jié)果提示,臨床上對子癇前期產(chǎn)婦提前留置導(dǎo)管進(jìn)行椎管內(nèi)阻滯,除了緩解疼痛,還可改善內(nèi)環(huán)境、降低血壓,進(jìn)而改善分娩結(jié)局。

本研究發(fā)現(xiàn)椎管內(nèi)阻滯可以減弱子癇前期孕鼠的糖萼脫落和炎癥反應(yīng),降低血壓并改善分娩結(jié)局。將來需進(jìn)一步明確內(nèi)皮細(xì)胞糖萼、炎癥反應(yīng)與膽堿能抗炎通路在子癇前期發(fā)病中的作用及機(jī)制,從而更好地發(fā)揮椎管內(nèi)阻滯對子癇前期的防治作用。