楊錫彤，馬 蓉，徐弘揚(yáng)，王光明△

(1.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院基因檢測(cè)中心,云南大理 671000;2.大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,云南大理 671000)

腦卒中是一種突發(fā)性的腦血液循環(huán)障礙性疾病，全球每年大約有1 500萬新發(fā)病的腦卒中患者；腦卒中后患者生活不能自理，致殘率高達(dá)50%；因腦卒中而導(dǎo)致的病死率高達(dá)20%[1-2]。腦卒中是由多因素引起的復(fù)雜神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其中包括遺傳因素及環(huán)境因素，而流行病學(xué)的研究認(rèn)為腦卒中的發(fā)生與遺傳因素有較大的關(guān)系[3]。

微小RNA(microRNA,miR)是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNAs，在真核細(xì)胞中主要是由19～25個(gè)核苷酸組成，通過與基因信使RNA(mRNA)3′非編碼端相結(jié)合，通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因的表達(dá)，因此miR參與了包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡和新陳代謝等一系列重要的生命進(jìn)程[4-5]。單核苷酸基因多態(tài)性(SNP)是常見的遺傳變異之一，主要存在于前體miR(pre-miR)，可影響成熟miR的表達(dá)。當(dāng)前的研究表明，SNP的位點(diǎn)存在于4種前體miR，包括miR-146aC>G(rs2910164),miR-149T>C(rs2292832),miR-196a2T>C(rs11614913)和miR-499A>G (rs3746444)[6-7]。這4種miR能影響血管損傷反應(yīng),miR-146a，miR-149，miR-196a2和miR-499等位基因分別與腫瘤調(diào)節(jié)因子-α(TNF-α)、四氫葉酸還原酶、膜聯(lián)蛋白1(ANXA1)、C反應(yīng)蛋白(CRP)的調(diào)控有關(guān)[8-9],這些miRNA靶點(diǎn)與循環(huán)系統(tǒng)中的血栓或炎癥通路有關(guān)[10]。本研究擬通過對(duì)已發(fā)表的miR-146aC>G、miR-149T>C、miR-196a2T>C和miR-499A>G基因多態(tài)性與腦卒中的相關(guān)性研究進(jìn)行Meta分析，以得出較為客觀的結(jié)論。

1 資料與方法

1.1檢索策略 電子檢索PubMed、Web of Science、CBM及知網(wǎng)、萬方、維普中文數(shù)據(jù)庫，檢索時(shí)間從建庫至2018年7月，獲取有關(guān)miR基因多態(tài)性和腦卒中的文章。為提高文獻(xiàn)的查全率和漏查率，分析過程中將進(jìn)一步對(duì)入選研究的參考文獻(xiàn)進(jìn)行擴(kuò)大檢索，輔以文獻(xiàn)追溯法查找相關(guān)文獻(xiàn)，以提高M(jìn)eta分析對(duì)文獻(xiàn)查全率的要求。英文檢索詞包括miR、miR-146a、miR-149、miR-196a2和miR-499、polymorphism、SNP、stroke、ischemia、IS、cerebrovascular disease、brain hemorrhage、intracranial hemorrhage、cerebral hemorrhage、cerebral infarction,中文檢索詞包括miR-146a、miR-149、miR-196a2和miR-499、微小RNA、基因多態(tài)性、腦卒中、腦缺血、腦血管疾病、腦出血、腦梗死。

1.2文獻(xiàn)納入與排除標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①研究對(duì)象，評(píng)估m(xù)iR-146a、miR-149、miR-196a2、miR-499基因多態(tài)性和腦卒中發(fā)病的相關(guān)性；②研究設(shè)計(jì)，文章為病例對(duì)照研究；③干預(yù)措施，病例組為腦卒中患者，對(duì)照組為健康人群；④足夠充分的數(shù)據(jù)可用于計(jì)算OR值；⑤對(duì)照組基因型分布符合H-W遺傳平衡定律(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)： ①重復(fù)研究、發(fā)表的文獻(xiàn)；②數(shù)據(jù)描述不清或樣本資料交代不清，統(tǒng)計(jì)方法不恰當(dāng)；③腦卒中診斷不明確或沒有根據(jù)國際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)；④綜述文獻(xiàn)；⑤非中、英文文獻(xiàn)。

1.3質(zhì)量評(píng)估 對(duì)納入文獻(xiàn)的質(zhì)量評(píng)價(jià)采Newcastle-Ottawa量表(NOS)評(píng)價(jià)，通過入選人群、組間可比性、暴露因素測(cè)量3個(gè)方面共8個(gè)條目對(duì)文獻(xiàn)質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，滿分為9分，6分及以上認(rèn)為是高質(zhì)量文獻(xiàn)[11-12]，評(píng)價(jià)項(xiàng)目包括(1)病例確定是否恰當(dāng)，1分；(2)病例的代表性，1分；(3)對(duì)照組的選擇，1分；(4)對(duì)照組的確定，1分；(5)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析時(shí)考慮病例組和對(duì)照組的可比性，2分；(6)暴露因素的確定，1分； (7)病例組和對(duì)照組暴露因素的確定方法相同，1分；(8)無應(yīng)答率，1分。

1.4數(shù)據(jù)提取 參考Cochrane協(xié)作網(wǎng)推薦的方法編制資料提取表,由2名研究者獨(dú)立篩選文獻(xiàn)、提取資料并進(jìn)行交叉核對(duì),如有不一致觀點(diǎn)通過討論進(jìn)行解決。提取資料的主要內(nèi)容為:(1)文獻(xiàn)的基本特征 (包括文題、年份、研究者姓名等)；(2)所納入文獻(xiàn)研究對(duì)象的基本特征、干預(yù)措施和結(jié)局指標(biāo)。研究特征：研究地區(qū)和人群特征、研究組和對(duì)照組的例數(shù)和年齡特征；數(shù)據(jù)提?。貉芯拷M和對(duì)照組的各基因型的分布情況。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Review Manager5.3軟件進(jìn)行Meta分析，計(jì)數(shù)資料的效應(yīng)指標(biāo)選取比值比(OR)及其95%可信區(qū)間(CI)表示。異質(zhì)性檢驗(yàn)采用Q檢驗(yàn)和I2統(tǒng)計(jì)量,如果異質(zhì)性檢驗(yàn)結(jié)果P≥0.05、I2<50%,表示各研究間無異質(zhì)性,選用固定效應(yīng)模型，計(jì)算合并比值并繪制森林圖；如果異質(zhì)性檢驗(yàn)結(jié)果P<0.05、I2>50%,表示研究間存在異質(zhì)性,選用隨機(jī)效應(yīng)模型。計(jì)算合并的OR和95%CI，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1納入的文獻(xiàn)基本特征 初步檢索出文獻(xiàn)146篇，按照文獻(xiàn)納入排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，最終剩余11篇文獻(xiàn)(圖1)，文獻(xiàn)對(duì)照組都符合HWE，共計(jì)8 493例研究對(duì)象，其中病例組4 179例，對(duì)照組4 314例，納入研究的基本特征及對(duì)照組的HWE檢測(cè)見表1～4。

圖1 文獻(xiàn)篩選流程圖

表1 納入研究的miR-146a rs2910164的基本特征

a為研究對(duì)象的年齡段

表2 納入研究的miR-149 rs2292832的基本特征

表3 納入研究的miR-196a2 rs11614913的基本特征

a為研究對(duì)象的年齡段

表4 納入研究的miR-499 rs3746444的基本特征

2.2Meta分析的結(jié)果

2.2.1miR-146a rs2910164 對(duì)5種遺傳學(xué)模型(Gvs. C、GGvs. CC、GCvs. CC、GG+GCvs. CC、GGvs. GC+CC)進(jìn)行Meta分析，結(jié)果表明攜帶G或GG基因的人群并未增加腦卒中的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)(P>0.05)，見表5。

2.2.2miR-149 rs2292832 對(duì)5種遺傳學(xué)模型(Cvs. T、CCvs. TT、CTvs. TT、CC+CTvs. TT、CCvs. CT+TT)進(jìn)行Meta分析，結(jié)果表明miR-149 rs2292832基因多態(tài)性與腦卒中有相關(guān)性，人群中攜帶C或CC基因明顯增加了腦卒中的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，見表6。

2.2.3miR-196a2 rs11614913 對(duì)5種遺傳學(xué)模型(Cvs. T,CCvs. TT,CTvs. TT,CC +CTvs. TT,CCvs. CT+TT)進(jìn)行Meta分析，結(jié)果表明miR-196a2 rs11614913多態(tài)性與腦卒中的發(fā)生無相關(guān)性，見表7。

表5 miR-146a rs2910164 5種遺傳學(xué)模型森林圖結(jié)果統(tǒng)計(jì)

表6 miR-149 rs2292832 5種遺傳學(xué)模型森林圖結(jié)果統(tǒng)計(jì)

表7 miR-196a2 rs11614913 5種遺傳學(xué)模型森林圖結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.2.4miR-499 rs3746444 對(duì)5種遺傳學(xué)模型(Gvs. A,GGvs. AA,GAvs. AA,GG+GAvs. AA,GGvs. GA+AA)進(jìn)行Meta分析，結(jié)果表明miR-499 rs3746444多態(tài)性與腦卒中的發(fā)生無相關(guān)性，見表8。

表8 miR-499 rs3746444 5種遺傳學(xué)模型森林圖結(jié)果統(tǒng)計(jì)

3 討 論

腦卒中的危險(xiǎn)因素包括動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、血脂異常和高同型半胱氨酸血癥，這些都屬于疾病因素，而目前多數(shù)臨床研究表明遺傳因素導(dǎo)致腦卒中發(fā)生的比例明顯增加[24]。miR在許多生理和病理過程中，包括腫瘤發(fā)生、增殖、造血作用、代謝、免疫功能、表觀遺傳學(xué)和神經(jīng)退行性病變疾病，發(fā)揮著重要作用[25]。近年新的研究表明，循環(huán)miR可能是心血管疾病的新生物標(biāo)記物，包括急性心肌梗死、心力衰竭、冠狀動(dòng)脈疾病、糖尿病、腦卒中、原發(fā)性高血壓和急性肺栓塞[26]。近年來有關(guān)miR基因多態(tài)性與腦卒中易感性的研究越來越多，但因?yàn)槿巳汉偷貐^(qū)存在差異導(dǎo)致同一種族最后的研究結(jié)果不盡相同。因此，本研究通過對(duì)miR基因多態(tài)性與亞洲人群腦卒中易感性進(jìn)行Meta分析，揭示miR基因多態(tài)性與腦卒中之間的相關(guān)性，明確遺傳因素對(duì)腦卒中診斷的意義。

4種miR多態(tài)性在前體miR中的序列，miR-146a C>G rs2910164位于5號(hào)染色體，159912418；miR-149 T>C rs2292832位于2號(hào)染色體，241395503；miR-196a2T>C rs11614913位于12號(hào)染色體，54385599；miR-499A>G rs3746444位于20號(hào)染色體，33578251[4-5]。這4種miR與血管損傷密切相關(guān)，miR-146、miR-149、miR-196a2和miR-499 分別調(diào)控TNF-α、四氫葉酸還原酶、ANXA1和CRP。TNF-α、四氫葉酸還原酶、ANXA1和CRP是導(dǎo)致腦卒中的一般原因。TNF-α與纖溶酶原激活物抑制劑1水平的升高有關(guān)，四氫葉酸還原酶功能障礙與血漿總同型半胱氨酸(tHcy)積累有關(guān)，ANXA1與TNF-α水平降低有關(guān)，CRP可以升高血壓，而在壓力條件下CRP和TNF-α能被同時(shí)激活[10]。這些研究表明，TNF-α、 ANXA1和 CRP之間有密切聯(lián)系。事實(shí)上，盡管存在數(shù)據(jù)的限制性，但仍然有miR多態(tài)性功能的研究。miR-146a G和miR-196a2 T與成熟miR水平降低有關(guān)。miR-149T>C和miR-499A>G均未見成熟miR表達(dá)，然而miR-499A與血漿CRP水平降低有關(guān)，由此可知，作者懷疑miR-146a、miR-149、miR-196a2和miR-499 等位基因能夠通過抑制TNF-α 和 CRP水平在腦卒中的發(fā)病機(jī)制中起到保護(hù)性作用[27]。

本研究結(jié)果表明，miR-146a、miR-149、miR-196a2及miR-499僅有miR-149 rs2292832基因多態(tài)性與腦卒中易感性相關(guān)，等位基因C和CC基因型明顯增加腦卒中的患病風(fēng)險(xiǎn)。人群中攜帶CC基因型葉酸水平明顯低于TT基因型[22]，miR-149通過與四氫葉酸還原酶的mRNA-3′UTR結(jié)合調(diào)控四氫葉酸還原酶基因的表達(dá)[27]。四氫葉酸還原酶在甲硫酸-葉酸的編碼代謝中發(fā)揮著重要作用，人體內(nèi)具有活性的miR-149-5p在四氫葉酸形成過程中起到促進(jìn)作用[28]。miR-149 rs2292832位于miR-149前體非成熟結(jié)合區(qū)內(nèi)，rs2292832能影響miR-149-5p表達(dá)，CC基因型人群中miR-149-5p的表達(dá)水平明顯高于CT基因型和TT基因型[29]。有研究表明，體內(nèi)的四氫葉酸還原酶表達(dá)的降低能增加腦卒中發(fā)病率，而腦卒中患者的葉酸水平明顯比健康人群低，通過補(bǔ)充葉酸腦卒中的患病率得到明顯改善[8，10]。因此可認(rèn)為miR-149 rs2292832 C等位基因和CC基因型通過影響成熟miR-149，調(diào)控miR-149與四氫葉酸還原酶基因的結(jié)合，降低四氫葉酸還原酶基因表達(dá)，抑制甲硫酸-葉酸代謝，降低體內(nèi)5-甲基四氫葉酸的生成，從而增加腦卒中的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

本研究納入文獻(xiàn)僅限于中英文符合要求的文獻(xiàn)，研究人群為亞洲人群。亞洲人群miR基因多態(tài)性與腦卒中易感性相關(guān)性更合理、更可靠的結(jié)論依賴于開展大樣本、多中心、同質(zhì)性的病例對(duì)照研究。本次研究存在一定的局限性，希望擴(kuò)大樣本量和提高文獻(xiàn)質(zhì)量來完善本次研究，最終也需要擴(kuò)大地區(qū)差異以進(jìn)一步驗(yàn)證分析結(jié)果。

綜上所述，在miR中，miR-149 rs2292832基因多態(tài)性與腦卒中的發(fā)生有相關(guān)性，臨床醫(yī)生應(yīng)對(duì)遺傳因素引起腦卒中的發(fā)生予以重視。