吳振，李紅，陳崗，楊勇,3，汪敏，田圓，劉元

1(重慶市中藥研究院，中藥健康學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶，400065) 2(重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶，401121) 3(重慶市中藥大健康工程技術(shù)研究中心，重慶，400065)

柚(CitrusgrandisL. Osbeck)俗稱拋?zhàn)?、團(tuán)圓果、文旦等，屬蕓香科(Rutaceae)柑橘屬(Citrus)植物，素有“天然水果罐頭”之稱。柚原產(chǎn)中國(guó)，其栽培歷史悠久，變異類型及品種甚多，我國(guó)柚類品種、品系、類型和株系多達(dá)200個(gè)以上[1]。柚果肉富含礦物質(zhì)與微量元素[2-3],關(guān)于柚子中元素含量的研究未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道。食品中必需宏量元素和微量元素的含量對(duì)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及其活性機(jī)理有重要影響，甚至發(fā)揮著關(guān)鍵作用；果蔬中元素?cái)z入與機(jī)體的健康、生長(zhǎng)發(fā)育和疾病預(yù)防有著密切關(guān)系，對(duì)體內(nèi)多種活性酶和免疫過(guò)程也有直接或間接作用[4-6]。

目前，無(wú)機(jī)元素指紋分析已廣泛應(yīng)用于果蔬、農(nóng)產(chǎn)品及其他食品原料的品質(zhì)評(píng)價(jià)及其質(zhì)量控制[7-12]，而化學(xué)計(jì)量學(xué)方法為無(wú)機(jī)元素指紋數(shù)據(jù)解析發(fā)揮了不可替代的作用[13]，因?yàn)榛瘜W(xué)計(jì)量學(xué)方法能夠發(fā)現(xiàn)食品原料與化學(xué)成分之間的內(nèi)在聯(lián)系[14]。無(wú)機(jī)元素測(cè)定結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法已經(jīng)逐漸用于紅棗、辣椒、檸檬、番茄的品質(zhì)評(píng)價(jià)與產(chǎn)地溯源[15-17]。偏最小二乘判別分析(partial least-squares discriminant analysis，PLS-DA)和聚類分析(clustering analysis，CA)作為經(jīng)典的化學(xué)計(jì)量學(xué)中“無(wú)監(jiān)督分類”方法，常用于食品及其原料的品質(zhì)評(píng)價(jià)、產(chǎn)地識(shí)別、摻假鑒別[15, 18]。本實(shí)驗(yàn)采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry，ICP-AES)測(cè)定不同品種柚果肉中Al、B、Ba、Ca、Co、Cu、Na、K、Fe、Mg、Mn、Zn、Ni、Se、Cr、V、Sr 17種無(wú)機(jī)元素的含量，建立柚五類品種果肉中無(wú)機(jī)元素的PLS-DA和CA模型，為我國(guó)柚品種特性比較、品種劃分及其綜合利用提供了基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)材料為完全成熟的柚水果(柚子種質(zhì)資源共67份)：沙田柚(n=13)、玉環(huán)柚(n=14)、脆香甜柚(n=13)、琯溪蜜柚(n=12)、梁平柚(n=15)，具體見(jiàn)表1(每種柚取樣3次，分別測(cè)定3次)；各品種均由重慶市中藥研究院專家鑒定。Al、B、Ba、Ca、Co、Cd、Cu、Na、K、Fe、Mg、Mn、Zn、Ni、As、Pb、Se、Hg、Cr、V和Sr標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100 mg/L) 國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；HNO3、高氯酸均為優(yōu)級(jí)純；所用溶液均利用去離子水自行配制；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

Optima 7000DV型全譜直讀電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀，美國(guó)Perkin Elmer公司；DFY-500D高速粉碎，機(jī)上海新諾儀器設(shè)備有限公司；DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司。

表1 柚子樣品編號(hào)及其產(chǎn)地Table 1 The sample number and origin of pomelo

1.3 方法

1.3.1 柚采摘方法及其果肉預(yù)處理方法

分別選樹(shù)齡一致、生長(zhǎng)正常、結(jié)果量基本相同的柚樹(shù)3株，于成熟期挑選外觀顏色和果實(shí)大小相當(dāng)、果面無(wú)明顯機(jī)械傷的正常果；樣品用純凈水沖洗干凈，剝皮，去籽，取其中鮮果肉陰干后，于50 ℃干燥箱中烘干至恒重，粉碎后過(guò)60目篩。

1.3.2 消化方法

所用玻璃器皿均用1%HNO3浸泡12 h，再用去離子水沖洗2～3遍，烘干備用。將干燥柚果肉粉末(5.00 g)置于潔凈的250 mL玻璃圓底燒瓶，加入一定量的HNO3-HClO4(體積比4∶1)加熱消化完全(注意及時(shí)補(bǔ)加混酸，當(dāng)溶液變?yōu)榍辶翢o(wú)色并伴有白煙時(shí)，繼續(xù)加熱至近干，向圓底燒瓶中加入少量超純水繼續(xù)加熱以趕盡多余的高氯酸，蒸發(fā)至近干)，冷卻至室溫，加HNO310 mL及適量水并定容于50 mL容量瓶中成為待測(cè)液。

1.3.3 柚果肉中無(wú)機(jī)元素測(cè)定方法及條件

采用ICP-AES技術(shù)測(cè)定，具體參考姚鑫等方法[19]。儀器參數(shù)：射頻功率1 350 W；檢測(cè)器CID的高波段(>265 nm)積分時(shí)間5 s，低波段(<265 nm)積分時(shí)間15 s；進(jìn)樣霧化器氬氣壓力28 psi；進(jìn)樣蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速：100 r/min；輔助氣流量1.0 L/min，載氣流速1.12 L/min；測(cè)定波長(zhǎng)范圍：188.979～396.153 nm。標(biāo)液質(zhì)量濃度分別為10、20、40、80、100 μg/L，測(cè)定并計(jì)算各柚果肉樣品中無(wú)機(jī)元素含量。

1.3.4 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法

顯著性分析采用SAS 8.2(SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA)的LSD(least significant difference)方法，P<0.05表示差異顯著。采用SIMCA-P(SIMCA-P 13.0；Umetrics，Umea，Sweden)對(duì)已標(biāo)準(zhǔn)化處理的無(wú)機(jī)元素矩陣數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，建立其PLS-DA和CA模型，并計(jì)算其特征值和貢獻(xiàn)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 柚果肉中17種主要無(wú)機(jī)元素含量測(cè)定及其分布分析

目前ICP-AES方法廣泛應(yīng)用于食品及其原料中多種無(wú)機(jī)元素測(cè)定，已經(jīng)成為元素分析和測(cè)定的主流方法[20]。采用ICP-AES測(cè)定了柚果肉中21種主要的無(wú)機(jī)元素含量，結(jié)果見(jiàn)表2，其中所有樣品中Cd、Pb、As、Hg均未檢出；柚果肉中富含有益元素Ca、K、Fe、Mg、Mn，其平均含量分別達(dá)到341.54、844.45、11.54、197.85、6.76 μg/g。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)不同品種柚果肉常量元素和微量元素差異較大，但均為低Na和高K水果。重金屬均符合GB 2762—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》中“水果及其制品”的限量要求。柚果肉無(wú)機(jī)元素差異主要與品種、產(chǎn)地土壤環(huán)境、測(cè)定方法等因素相關(guān)，柚果肉的重金屬元素含量較低，說(shuō)明所采集各產(chǎn)區(qū)柚基本無(wú)重金屬污染，并且其植物果肉重金屬富集和遷移率較低，對(duì)于我國(guó)整體柚資源的重金屬情況，具有一定的參考價(jià)值。

2.2 PLS-DA模型分析柚果肉中17種主要的無(wú)機(jī)元素

2.2.1 PLS-DA模型主因子(F)提取過(guò)程分析

PLS-DA是一種基于偏最小二乘回歸算法的線性分類方法，該模型適用于多自變量并且線性強(qiáng)情況的分析和預(yù)測(cè)，該技術(shù)已成為化學(xué)計(jì)量建模中的一種成熟工具，因?yàn)樗ǔ？梢詮膬?nèi)部本質(zhì)角度來(lái)解釋所提取的主因子[21]。對(duì)柚果肉無(wú)機(jī)元素采用PLS-DA分析，所提取的4因子模型的特征值(Ev)分別為500.284、102.306、26.087、5.937，對(duì)應(yīng)的方差貢獻(xiàn)率分別為：78.833%、16.121%、4.111%和0.936%；其中前3個(gè)主因子(即F1、F2和F3)的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到99.065%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于85%，說(shuō)明該P(yáng)LS-DA模型能夠完整和準(zhǔn)確反映不同品種柚果肉中無(wú)機(jī)元素的分布情況。F2與B、V的變化相關(guān)，F(xiàn)3與Mg、Mn的相關(guān)性非常強(qiáng)，而其余的無(wú)機(jī)元素均與F1相關(guān)性較高。因此我們將PLS-DA模型的前3個(gè)主因子作為評(píng)價(jià)不同品種柚子中17種主要無(wú)機(jī)元素及柚品質(zhì)的代表性變量。

2.2.2 基于PLS-DA模型的柚不同品種的分類分析

分別以PLS-DA模型的主因子F1為X軸、F2為Y軸(或以F1為X軸、F3為Y軸)，將67份柚樣品分別標(biāo)入二維坐標(biāo)系中，即得到主因子得分的二維圖，具體見(jiàn)圖1。由圖1-a和圖1-b可知，該模型明確將67份柚樣品分為五類，說(shuō)明該P(yáng)LS-DA模型可以作為不同品種柚分類的識(shí)別方法。由圖1-a可知，脆香甜柚和沙田柚分別位于PLS-DA模型分類圖的上方和下方，梁平柚和琯溪蜜柚分別位于PLS-DA模型分類圖左側(cè)和右側(cè)，而玉環(huán)柚分布略微居中。此外，脆香甜柚和沙田柚樣品分布更加聚集，說(shuō)明其個(gè)體差異較?。挥癍h(huán)柚、琯溪蜜柚和梁平柚分布略微分散，說(shuō)明其個(gè)體差異和栽培環(huán)境等因素影響較大。因此，PLS-DA模型結(jié)合無(wú)機(jī)元素分布可應(yīng)用于不同品種柚的分類分析。

表2 不同品種柚子中無(wú)機(jī)元素含量 單位：μg/g

注：Max、Min、Mean和S.D.分別表示最大值、最小值、平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差；不同小寫(xiě)字母(a～j)表示各無(wú)機(jī)元素最大值、最小值之間具有顯著性差異(P<0.05)；“-”表示無(wú)。每個(gè)指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3次。

a-基于主因子F1和F2的分布圖；b-基于主因子F1和F3的分布圖圖1 基于PLS-DA模型的不同品種柚樣品分布散點(diǎn)圖Fig.1 Scatter plots based on PLS-DA model of pomelo from different varieties注：圖中數(shù)字1～5分別表示沙田柚、玉環(huán)柚、脆香甜柚、琯溪蜜柚、梁平柚；Centroids表示每一類的中心

圖2 基于PLS-DA模型的柚無(wú)機(jī)元素載荷圖Fig.2 The loading plot of element of pomelo based PLS-DA model

2.3 柚子無(wú)機(jī)元素含量相關(guān)性及其聚類分析

采用SAS 8.2軟件對(duì)柚子果肉中17種主要的無(wú)機(jī)元素進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)性用皮爾遜(Pearson)相關(guān)系數(shù)表示，聚類分析按相近或相似程度分組，相似性的度量是基于歐氏距離平方，最小的距離表示其關(guān)系程度最高，因此，這些對(duì)象被認(rèn)為屬于同一組[29]。相關(guān)性和聚類結(jié)果如圖3所示。顯著性分析發(fā)現(xiàn)，柚果肉中有2對(duì)元素(Fe與Ba、Fe與Mn)間呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)(P<0.01)，42對(duì)元素間呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，雖然不同元素的吸收與富集機(jī)理不盡相同，但各元素間可能存在相互協(xié)同或促進(jìn)吸收的關(guān)系；并且柚在富集以上元素時(shí)表現(xiàn)出較強(qiáng)的協(xié)同作用，可能與柚子植物吸收代謝、土壤元素狀態(tài)等因素相關(guān)；已知植物的微量元素含量受植物品種、土壤條件、氣候、肥料的使用和收獲時(shí)植物的成熟狀態(tài)等因素的影響[30]。柚果肉中有1對(duì)元素(Al與Ba)之間呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，25對(duì)元素間呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，表現(xiàn)出元素間可能具有相互拮抗吸收的關(guān)系；其余各元素之間多存在正相關(guān)趨勢(shì)，但均未達(dá)到顯著性水平。聚類分析發(fā)現(xiàn)，17個(gè)無(wú)機(jī)元素基本聚為四大類：Na、Co、Se、Mg、Cu和Zn聚為第一類(其中Na、Co、Se與Mg、Cu、Zn分別來(lái)于2個(gè)小類)，Cr和B聚于第二類，V、Ni和Al聚為第三類，Sr、K、Ca、Mn、Ba和Fe聚為第四類(Sr、K、Ca與Mn、Ba、Fe分別來(lái)于兩個(gè)小類)，在一定程度上說(shuō)明了各個(gè)元素在果肉中積累過(guò)程中的內(nèi)在聯(lián)系。陳巍等[31]研究發(fā)現(xiàn)柚葉片與果實(shí)之間礦質(zhì)元素協(xié)同吸收作用較弱，而柚子果實(shí)與果皮之間作用較強(qiáng)。一般根據(jù)特征成分、生物學(xué)特征等分析變量與種質(zhì)之間的相互關(guān)系，為柚類種質(zhì)資料調(diào)查、品種分類系統(tǒng)的建立、品種溯源與劃分、產(chǎn)品的合理開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)[32]。無(wú)機(jī)元素在這方面體現(xiàn)了其自身優(yōu)勢(shì)，表明不同品種的柚子果肉其無(wú)機(jī)元素產(chǎn)量存在較大差異，這種差異還能夠進(jìn)一步作為不同品種柚子劃分的參考依據(jù)，進(jìn)一步揭示了通過(guò)測(cè)定無(wú)機(jī)元素，對(duì)柚子的種質(zhì)資源調(diào)查、品種劃分具有參考價(jià)值。該聚類分析在一定程度上解釋了柚果肉中無(wú)機(jī)元素的分布特征和積累的內(nèi)在聯(lián)系。該方法為無(wú)機(jī)元素含量與化學(xué)計(jì)量學(xué)技術(shù)相結(jié)合作為評(píng)價(jià)柚子品質(zhì)和品種鑒定提供了有價(jià)值的基礎(chǔ)。我們后續(xù)將分析柚不同部位(如果皮、柚果實(shí)囊衣、種子等)的無(wú)機(jī)元素組成及其遷移規(guī)律，建立指紋圖譜，為柚的品種選育、引種栽培、良種繁育、污染防控、柚副產(chǎn)物(花、葉、柚皮等)綜合利用提供依據(jù)。

圖3 柚無(wú)機(jī)元素的相關(guān)性和聚類結(jié)果Fig.3 The correlation and its cluster result of the elements of pomelo

3 結(jié)論

(1)柚果肉樣品中Cd、Pb、As和Hg均未檢出，柚果肉中Ca、K、Fe、Mg和Mn等有益元素含量較高，其平均含量分別達(dá)到341.54、844.45、11.54、197.85、6.76 μg/g；同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)不同品種柚果肉其常量元素和微量元素差異較大，但均為低Na和高K水果。

(2)采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法結(jié)合ICP-AES測(cè)定柚果肉無(wú)機(jī)元素組成，可區(qū)分和評(píng)價(jià)沙田柚、玉環(huán)柚、脆香甜柚、琯溪蜜柚、梁平柚，能夠揭示各品種柚無(wú)機(jī)元素之間的差異、污染狀態(tài)及其綜合品質(zhì)。

(3)通過(guò)PLS-DA模型分析不同品種柚的無(wú)機(jī)元素分布差異，PLS-DA模型提取的前3個(gè)主因子所代表的信息可以明顯區(qū)分各品種的柚果肉，相關(guān)性和聚類分析揭示了柚的無(wú)機(jī)元素之間的協(xié)同或拮抗吸收內(nèi)在的機(jī)制，為柚的品種選育、綜合利用提供理論依據(jù)。