邢世均，石玲，劉廣娟，周燁，龔彩霞，王子榮

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院， 新疆 烏魯木齊，830000)

新疆光熱資源豐富，晝夜溫差大，有利于葡萄的生長(zhǎng)。據(jù) 2018 年統(tǒng)計(jì)，新疆葡萄種植面積約 14.4萬(wàn)公頃，年產(chǎn)量約 270.6 萬(wàn)t[1]。葡萄種植過(guò)程中，病害時(shí)有發(fā)生，新疆葡萄病害主要有霜霉病、白粉病和炭疽病等[2]。為減少經(jīng)濟(jì)損失，常使用化學(xué)殺菌劑預(yù)防和治療病害，由于管理缺乏規(guī)范，甚至出現(xiàn)過(guò)量使用和濫用的情況，導(dǎo)致葡萄殺菌劑殘留，通過(guò)釀造過(guò)程轉(zhuǎn)移到葡萄酒中，給葡萄酒質(zhì)量安全帶來(lái)隱患。

農(nóng)藥殘留，一方面可能會(huì)對(duì)消費(fèi)者造成損害，另一方面也會(huì)影響葡萄酒的釀造過(guò)程。葡萄酒加工過(guò)程大體可以分為3個(gè)階段：酒精發(fā)酵(AF)，蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵(MLF)，陳釀。BRIZCID等[3]研究發(fā)現(xiàn)，在AF過(guò)程中一些殺菌劑會(huì)抑制或刺激酵母菌的活動(dòng)，進(jìn)而影響酒精發(fā)酵過(guò)程，甚至產(chǎn)生某些有害代謝產(chǎn)物或異味物質(zhì)，對(duì)葡萄酒品質(zhì)和感官質(zhì)量造成影響；李記明等[4]發(fā)現(xiàn)一定濃度的農(nóng)藥會(huì)改變AF發(fā)酵過(guò)程，同時(shí)造成感官質(zhì)量明顯下降。RUEDIGER等[5]在研究農(nóng)藥對(duì)MLF的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，農(nóng)藥在一定程度上也會(huì)影響乳酸菌活性，改變MLF進(jìn)程，影響葡萄酒品質(zhì)。

CABRAS等[6]提出發(fā)酵過(guò)程中農(nóng)藥與酵母是相互作用的。一方面，農(nóng)藥影響發(fā)酵的活動(dòng)；另一方面，發(fā)酵也能降低農(nóng)藥殘留。農(nóng)藥會(huì)在葡萄酒釀造過(guò)中被皮渣、酒泥及澄清劑吸附，使得殘留量降低，不同程度的降解，不同種類(lèi)農(nóng)藥在固體相(酒泥和皮渣)與葡萄酒兩相中的分布差異較大[7-8]。OLIVA等[9]發(fā)現(xiàn)在下膠澄清過(guò)程中使用不同澄清劑可以有效去某些農(nóng)藥。綜上所述，農(nóng)藥會(huì)對(duì)葡萄酒品質(zhì)和感官質(zhì)量造成影響，釀造過(guò)程中農(nóng)藥殘留量也會(huì)降低，但不同農(nóng)藥對(duì)葡萄酒品質(zhì)影響程度或變化規(guī)律有差異。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)葡萄或葡萄酒農(nóng)藥殘留研究較多的主要是農(nóng)藥殘留的檢測(cè)手段和降解規(guī)律[10]。國(guó)內(nèi)研究殺菌劑對(duì)葡萄酒品質(zhì)的影響則較少。本文以“赤霞珠”葡萄為原料，研究生產(chǎn)中常使用的3種廣譜殺菌劑(嘧菌酯、甲基硫菌靈、甲霜靈)對(duì)葡萄酒釀造過(guò)程、品質(zhì)及感官質(zhì)量的影響，同時(shí)檢測(cè)釀造過(guò)程中3種農(nóng)藥含量的變化規(guī)律。目的是為釀酒葡萄殺菌劑的使用提供相應(yīng)理論指導(dǎo)，為葡萄酒農(nóng)藥殘留安全性標(biāo)準(zhǔn)的制定提供一定的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 葡萄品種

試驗(yàn)葡萄品種為有機(jī)“赤霞珠”，2018 年 9月 13 日在“國(guó)菲酒莊”采摘，選取生長(zhǎng)周期相近(可溶性固形物(22±0.5)%)、無(wú)機(jī)械損傷和病蟲(chóng)害的葡萄，散去田間熱后及時(shí)運(yùn)回。

1.2 儀器與試劑

UV-1700紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美析儀器有限公司；UPHE-Ⅲ-90T超純水機(jī)，四川優(yōu)普超純科技有限公司；R1001-VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；3H16RI智能高速冷凍離心機(jī)，湖南赫西儀器設(shè)備有限公司；FE22 pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器有限公司；LE204E/02萬(wàn)分之一天平，特勒-托利多儀器有限公司；TQS micro液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Waters公司；Sun FIreTMC18色譜柱(2.1 mm×100 mm，3.5 μm)，美國(guó)Waters公司。

甲基硫菌靈、甲霜靈、嘧菌酯、多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品:阿爾塔科技有限公司；QuEChERS萃取鹽包：上海島津；甲醇、甲酸、乙腈(色譜純):天津光復(fù)；釀酒酵母(Zymaflore F15)、乳酸菌:法國(guó)LAFFORT公司；其他未列出試劑均為分析純。

1.3 處理方法

1.3.1 農(nóng)藥添加

參照GB 2763—2016[11]，將其允許最高農(nóng)藥殘留量作為農(nóng)藥添加量，即甲基硫菌靈 5 mg/kg、甲霜靈2 mg/kg、嘧菌酯 2 mg/kg，以不添加農(nóng)藥為對(duì)照。

1.3.2 葡萄酒釀造工藝

葡萄原料除梗破碎、添加農(nóng)藥后裝入 20 L玻璃罐，加入60 mg/L SO2，浸漬 12 h，添加活化后的酵母啟動(dòng)發(fā)酵，酒精發(fā)酵溫度控制在 25～30 ℃，比重降至 1.015 時(shí)，分離皮渣，添加乳酸菌后繼續(xù)發(fā)酵至比重 0.992～0.996，添加50 mg/L SO2，終止發(fā)酵，倒罐澄清，隨后葡萄酒在 10 ℃下滿罐密封貯藏。試驗(yàn)酒樣設(shè)2次重復(fù)。

1.4 理化指標(biāo)的測(cè)定

殘?zhí)?、酒精度、pH、總酸的測(cè)定參照GB/T 15038—2006[12]葡萄酒、果酒通用分析方法；總酚的測(cè)定參照CLIFF等[13]的方法；花色苷的測(cè)定采用pH示差法[14]；色度和色調(diào)、總單寧、鹽酸指數(shù)、乙醇指數(shù)的測(cè)定參照彭傳濤等[15]的方法。

1.5 感官評(píng)價(jià)

感官品嘗小組成員由 15 名接受過(guò)專(zhuān)業(yè)感官培訓(xùn)的人員組成。評(píng)價(jià)小組分別從外觀(顏色 10 分，澄清度 5分)、香氣(濃度 10 分，質(zhì)量10分，濃郁度 15 分)、口感(風(fēng)味濃郁度 15 分，余味 15 分，平衡感 20 分)3個(gè)方面對(duì)葡萄酒進(jìn)行比較品嘗，總分為 100 分。使用 5分結(jié)構(gòu)化數(shù)值尺度來(lái)量化，0～4表示感覺(jué)強(qiáng)烈程度逐漸增大。

1.6 農(nóng)藥含量測(cè)定

嘧菌酯含量測(cè)定參照吳延燦等[16]的方法，甲霜靈含量測(cè)定參照徐娟等[17]的方法，GB 2763—2016 規(guī)定甲基硫菌靈的殘留定義為甲基硫菌靈和多菌靈的殘留總和，以多菌靈計(jì)。甲基硫菌靈、多菌靈含量測(cè)定參照王昕璐等[18]的方法，4 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。4種農(nóng)藥的相關(guān)系數(shù)R2均>0.99，表明4種農(nóng)藥峰面積在線性范圍內(nèi)與相對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Table 1 Standard Curve Equations

1.7 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010 和SPSS 19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，利用Duncan多項(xiàng)式進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05 表示差異顯著。使用Sigma Plot 14.0 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)藥對(duì)葡萄酒AF進(jìn)程的影響

如圖1，隨著葡萄酒發(fā)酵的進(jìn)行，各處理組葡萄醪發(fā)酵溫度整體上呈先上升后下降趨勢(shì)，發(fā)酵前 24 h，溫度上升速度較快。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，甲基硫菌靈和甲霜靈處理的葡萄醪溫度變化過(guò)程與CK組相比較差異不顯著，添加嘧菌酯的葡萄醪發(fā)酵溫度整體上低于CK組(P<0.05)。隨著AF發(fā)酵的進(jìn)行，各組比重呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，甲基硫菌靈和甲霜靈比重下降速度與CK組差異不顯著，發(fā)酵進(jìn)行 48 h后，嘧菌酯處理后的葡萄醪比重均高于同期各處理組(P<0.05)，推遲了AF約24 h，延長(zhǎng)了葡萄酒AF過(guò)程。

a-溫度;b-比重圖1 農(nóng)藥對(duì)發(fā)酵醪的影響Fig.1 Effects of pesticides on fermentation mash of wine

2.2 農(nóng)藥對(duì)葡萄酒品質(zhì)的影響

殘?zhí)?、總酸和酒精的含量與比例是影響葡萄酒品質(zhì)的重要因素，葡萄酒顏色是葡萄酒重要的感官特征，單寧和花色苷等多酚是葡萄酒顏色主要的呈色和穩(wěn)定物質(zhì)[19]，同時(shí)單寧還能賦予葡萄酒澀味和厚重感[20]，鹽酸指數(shù)和乙醇指數(shù)分別表示與多糖結(jié)合單寧比例和高聚合度單寧比例[21]。

由表2可看出，3種殺菌劑在不同程度上影響了葡萄酒的理化指標(biāo)，不同殺菌劑對(duì)葡萄酒品質(zhì)的影響不同。與CK相比，甲霜靈顯著降低了葡萄酒的色調(diào)、單寧、花色苷含量和鹽酸指數(shù)，同時(shí)顯著提高了殘?zhí)呛?P<0.05)，其中對(duì)鹽酸指數(shù)影響最大，鹽酸指數(shù)降低了25.63%。甲基硫菌靈對(duì)葡萄酒的色度、色調(diào)、總酚、花色苷的影響達(dá)到了顯著水平(P<0.05)，說(shuō)明甲基硫菌靈對(duì)葡萄酒的顏色影響較大。嘧菌酯對(duì)葡萄酒品質(zhì)影響最大，顯著提高了葡萄酒殘?zhí)?34.62%)、總酸(22.26%)、降低了酒精度(8.46%)、色度(3.25%)、總酚(5.88%)、單寧(8.78%)、花色苷(4.90%)、鹽酸指數(shù)(15.42%)和乙醇指數(shù)(0.52%)(P<0.05)。

表2 農(nóng)藥對(duì)葡萄酒品質(zhì)的影響Table 2 Effects of pesticides on wine quality

注：同行不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 農(nóng)藥對(duì)葡萄酒感官質(zhì)量的影響

由圖2可看出，不同殺菌劑對(duì)不同感官指標(biāo)的影響存在差異，3種殺菌劑對(duì)葡萄酒澄清度和色澤的影響較小，但3種農(nóng)藥在不同程度上影響了葡萄酒的香氣和風(fēng)味，其中甲基硫菌靈顯著降低了香氣質(zhì)量、濃度和純正度(P<0.05)，嘧菌酯對(duì)葡萄酒理化指標(biāo)影響較大，感官評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)該農(nóng)藥顯著降低了葡萄酒的平衡感和風(fēng)味濃郁度(P<0.05)，而甲霜靈對(duì)葡萄酒感官品質(zhì)影響較小。

圖2 農(nóng)藥對(duì)葡萄酒感官質(zhì)量的影響Fig.2 Effects of pesticides on sensory quality of wine

2.4 農(nóng)藥在釀造過(guò)程中的消減

由表3可看出，在葡萄釀造過(guò)程中3種農(nóng)藥含量均顯著降低，但3種農(nóng)藥降解率在不同相和不同階段中不同。陳釀 3個(gè)月后，3種農(nóng)藥在液體相均有明顯的降解(62.30%～82.98%)，平均為 73.79%，但降解程度會(huì)隨著農(nóng)藥種類(lèi)不同有所差異，說(shuō)明3種農(nóng)藥在葡萄酒中最終殘留量會(huì)顯著低于葡萄。本次試驗(yàn)同時(shí)測(cè)定了葡萄酒釀造3個(gè)階段(AF、MLF、陳釀)對(duì)農(nóng)藥的降解作用。結(jié)果表明，AF對(duì)農(nóng)藥降解作用最為明顯(43.98%～64.54%)，平均為 52.44%，而MLF(平均 40.74%)和陳釀(平均 11.16%)對(duì)農(nóng)藥降解作用較弱，即AF>MLF>陳釀。對(duì)AF結(jié)束液體相(酒)和固體相(皮渣)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)不同農(nóng)藥在兩相中的分配系數(shù)差異很大，嘧菌酯固液分配系數(shù)為 1.79∶1，甲基硫菌靈為1.43∶1，甲霜靈固液分配系數(shù)為 1.41∶1，說(shuō)明皮渣可以對(duì)嘧菌酯有很強(qiáng)的吸附作用，甲基硫菌靈次之，甲霜靈最弱，不同農(nóng)藥固液分配率不同。對(duì)MLF結(jié)束固液分配系數(shù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)嘧菌酯(4.51∶1)>甲基硫菌靈(2.11∶1)>甲霜靈(1.75∶1)，說(shuō)明皮渣對(duì)嘧菌酯吸附作用最強(qiáng)?？傮w來(lái)看，皮渣或酒泥對(duì)不同農(nóng)藥吸附作用不同。

表3 農(nóng)藥在葡萄酒不同相中的分布Table 3 Distribution of pesticides in different phases of wine

注：降解率/%=(初始農(nóng)藥含量-目標(biāo)農(nóng)藥含量)×100/初始農(nóng)藥含量。“-”表示未檢出。

3 討論

殺菌劑對(duì)葡萄酒釀過(guò)程造會(huì)產(chǎn)生一定的影響，農(nóng)藥可以通過(guò)影響酵母的繁殖或代謝過(guò)程來(lái)改變葡萄酒AF進(jìn)程[22]。農(nóng)藥殘留對(duì)葡萄酒釀造的影響會(huì)因農(nóng)藥種類(lèi)、劑量和酵母種類(lèi)而異。本研究發(fā)現(xiàn)嘧菌酯能延緩酒精發(fā)酵過(guò)程，造成殘?zhí)?、總酸含量升高，酒精度含量下?P<0.05)。這與李記明等[4]、MULERO等[23]的研究結(jié)果相似。嘧菌酯屬于甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑，可以抑制呼吸鏈中電子傳遞過(guò)程，進(jìn)而抑制糖酵解作用，延長(zhǎng)AF進(jìn)程。同時(shí)，嘧菌酯顯著降低了乙醇指數(shù)、鹽酸指數(shù)以及葡萄酒的平衡感和風(fēng)味濃郁度。甲基硫菌靈主要對(duì)葡萄酒香氣質(zhì)量和風(fēng)味影響較大，這可能是由于其分子中的含硫基團(tuán)和亞氨基在釀造過(guò)程中轉(zhuǎn)化為異味物質(zhì)的結(jié)果。甲霜靈對(duì)釀造過(guò)程和品質(zhì)影響相對(duì)較小。本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3種農(nóng)藥均對(duì)葡萄酒感官品質(zhì)造成了不良影響，這說(shuō)明農(nóng)藥改變了酵母的代謝過(guò)程，并產(chǎn)生了某些不良的代謝產(chǎn)物，這與NOGUEROLPATO等[24]、GARCIA等[25]研究農(nóng)藥對(duì)感官品質(zhì)和香氣物質(zhì)的影響結(jié)果相似。

葡萄酒發(fā)酵后其農(nóng)藥殘留的種類(lèi)和含量不同程度的減少或降低，其主要原因是皮渣和酒泥對(duì)農(nóng)藥的吸附作用[26]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3種農(nóng)藥經(jīng)AF、MLF及陳釀后，其含量平均減少70%以上，說(shuō)明經(jīng)發(fā)酵后葡萄酒農(nóng)藥含量會(huì)顯著低于葡萄，這與DOULIA等[27]研究結(jié)果一致。對(duì)比3個(gè)階段農(nóng)藥降解率，發(fā)現(xiàn)AF階段是農(nóng)藥降解或降低最快階段，結(jié)合AF后農(nóng)藥在固液分配情況，發(fā)現(xiàn)皮渣吸附嘧菌酯附作用最強(qiáng)，多菌靈次之，甲霜靈最弱，這可能與其極性弱，水溶性差的特點(diǎn)有關(guān)。嘧菌酯(6 mg/L、20 ℃)溶解度遠(yuǎn)小于甲霜靈(8.4 g/L、20 ℃)。NAVARRO等[28]和DANAE等[27]也認(rèn)為農(nóng)藥在葡萄破碎后的去除程度和農(nóng)藥的溶解度有很大關(guān)系，溶解度越低，極性越弱，去除程度越大，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

農(nóng)藥殘留和發(fā)酵過(guò)程相互影響，農(nóng)藥殘留會(huì)影響發(fā)酵進(jìn)程，發(fā)酵過(guò)程也會(huì)降低農(nóng)藥殘留，二者相互作用效果會(huì)因農(nóng)藥種類(lèi)、葡萄品種、釀造工藝等改變而變[29]。CUS等[8]認(rèn)為帶皮浸漬比去皮發(fā)酵更有利于農(nóng)藥去除，DOULIA等[30]研究不同澄清劑對(duì)農(nóng)藥吸附作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，活性炭、蛋清等澄清劑可以去除農(nóng)藥殘留，且農(nóng)藥水溶性越弱越容易去除。綜上所述，在實(shí)際生產(chǎn)中選擇水溶性弱農(nóng)藥，結(jié)合適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵工藝，有助于農(nóng)藥殘留的去除。

4 結(jié)論

3種農(nóng)藥在不同程度上改變了葡萄酒的發(fā)酵進(jìn)程，降低了葡萄酒的品質(zhì)和感官質(zhì)量。發(fā)酵過(guò)程會(huì)顯著降低農(nóng)藥含量，不同發(fā)酵階段對(duì)農(nóng)藥的降解作用不同，AF>MLF>陳釀。固相(皮渣、酒泥)對(duì)溶解度越低、極性越弱的農(nóng)藥吸附作用較強(qiáng)，此類(lèi)農(nóng)藥容易去除。