鄭雯，楊興變，康冀川，李洪慶,3*

1(貴州大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽，550025) 2(貴州大學(xué),西南特色藥用生物資源開發(fā)利用教育部工程研究中心，貴州 貴陽，550025) 3(貴州民族大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，貴州 貴陽，550025)

賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillusfusiformis)廣泛存在于海洋、土壤、植物體內(nèi)及動物體內(nèi)，該菌的發(fā)酵產(chǎn)物在各個領(lǐng)域中均有應(yīng)用潛力。有報道表明，賴氨酸芽孢桿菌可對食物和農(nóng)產(chǎn)品的黃曲霉毒素B1進(jìn)行降解[1]；劉貴友等[2]從土壤樣品中分離得到1株耐有機(jī)溶劑的賴氨酸芽孢桿菌CGMCC 4913，該菌能將葛根素轉(zhuǎn)化成葛根素-7-O-果糖苷；AHMAD等[3-4]從果蔬中分離得到賴氨酸芽孢桿菌JX416855、JX416856，2株菌具有抗食源性細(xì)菌的潛力；SEO等[5]從賴氨酸芽孢桿菌中分離得到一種可轉(zhuǎn)化蓖麻油酸的化合物10,12-dihydroxystearic acid，通過乳化活性實驗表明該化合物可用作生物表面活性劑。

芽孢桿菌在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生脂肽類、聚酮類、有機(jī)酸類、細(xì)菌素等[6-9]抗菌物質(zhì)，在食品保鮮、環(huán)境治理、植物病害防治和醫(yī)藥治療上具有極大的應(yīng)用價值。目前對賴氨酸芽孢桿菌發(fā)酵液抗真菌活性的研究較少，有文獻(xiàn)報道賴氨酸芽孢桿菌B-CM18對植物病原真菌的生長有抑制作用[10]，還沒有抗動物病原真菌方面的報道。

本研究對賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillusfusiformis)He14發(fā)酵液的抗真菌譜進(jìn)行初步研究，對發(fā)酵液中活性成分進(jìn)行了穩(wěn)定性考察及抑菌活性物質(zhì)富集方式的優(yōu)化，初步純化富集得到的活性粗產(chǎn)物，研究結(jié)果為賴氨酸芽孢桿菌的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillusfusiformis)He14、水稻紋枯病菌(Thanatephoruscucumeris)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)、煙草黑脛病菌(Phytophthoranicotianae)、辣椒灰霉病菌(Botrytiscinerea)、馬鈴薯早疫病菌(Alternariasolani)、馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)、須毛癬菌(Trichophytonmentagrophytes)、紅色毛癬菌(Trichophytonmbmm)：均由貴州大學(xué)貴州省生化工程中心分離保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

NB固體培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5，瓊脂20，121 ℃滅菌30 min。

NB液體培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5，121 ℃滅菌30 min。

PDA培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂20，121 ℃滅菌30 min。

1.1.3 儀器與設(shè)備

SFAT-8000C液體發(fā)酵自動控制系統(tǒng)，江蘇大學(xué)鎮(zhèn)江市江大科技有限公司；SA-1480-2水平層流潔凈工作臺，上海上凈凈化設(shè)備有限公司；PQX多段可編程人工氣候箱，寧波東南儀器有限公司；SORVALL Legend MICRO 21微量離心機(jī)，賽默飛世爾科技有限公司；R-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士BUCHI公司；PHS-25 pH測試儀，上海雷磁儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原真菌的活化

將6株植物病原真菌和2株動物病原真菌接種于9 cm的PDA培養(yǎng)皿中，28 ℃培養(yǎng)，待菌絲體長滿培養(yǎng)皿后，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株He14發(fā)酵液的制備

將菌株He14接種于NB固體培養(yǎng)基中，28 ℃活化培養(yǎng)24 h。制備NB液體培養(yǎng)基，于121 ℃滅菌30 min后接種活化好的菌株，作為種子液于28 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)24 h。將He14種子液以1%的接種量接種于裝有NB液體培養(yǎng)基的10 L發(fā)酵罐中，作為發(fā)酵液于28 ℃、120 r/min培養(yǎng)3 d。

1.2.3 菌株He14發(fā)酵液對不同病原真菌的抑制作用

取少量菌株He14的發(fā)酵液，經(jīng)4 200 r/min離心10 min后，上清液用細(xì)菌過濾器過濾，濾液采用生長速率法[11]進(jìn)行活性測定。即將發(fā)酵濾液和PDA培養(yǎng)基混合倒入培養(yǎng)皿中，制成含藥培養(yǎng)基，發(fā)酵液的質(zhì)量濃度為3 g/L，等量無菌水為空白對照。用5 mm打孔器對培養(yǎng)好的病原真菌自菌落邊緣切取菌餅，將菌餅放置于培養(yǎng)皿中央，菌絲面朝上，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至各病原真菌的空白對照菌絲長滿培養(yǎng)皿。通過十字交叉法測定菌落直徑，按公式(1)計算發(fā)酵濾液對各病原真菌菌絲生長的抑制率。

(1)

1.2.4 發(fā)酵液抗真菌成分的穩(wěn)定性

在不同溫度(0、20、40、60、80、100 ℃)處理發(fā)酵液 1 h 后測定抑真菌活性效果；用10%(體積分?jǐn)?shù))HCl和100 g/L NaOH調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值(1、3、5、7、9、11、13) 2 h后再調(diào)回到初始pH值7.85，測定抑真菌活性效果；將發(fā)

酵液置于30 W紫外燈下照射30、60、90、120、150、180 min，以未經(jīng)紫外照射的發(fā)酵液做為對照測定抑真菌活性效果。指示病原真菌為辣椒灰霉病菌。

1.2.5 不同方法富集發(fā)酵液的抑菌活性成分

將發(fā)酵液分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇按1∶1(體積比)萃取2次，合并相同的有機(jī)層及水層，濃縮至干測定抑真菌活性；使用明礬、AlCl3、FeSO4、Al2(SO4)3處理發(fā)酵液后取上清液及沉淀物測定抑真菌活性；選用非極性大孔吸附樹脂D101、LX-60，中等極性大孔吸附樹脂LSA-12、XDA-6，極性大孔吸附樹脂LX-17、XDA-8G對發(fā)酵液進(jìn)行吸附，用乙醇進(jìn)行洗脫，將流出液與洗脫液分別濃縮至干，得粗產(chǎn)物，測定其抑真菌活性。指示病原真菌為辣椒灰霉病菌。

1.2.6 活性粗產(chǎn)物的純化與活性篩選

將經(jīng)過富集處理的活性粗產(chǎn)物用硅膠柱層析，通過瓊脂擴(kuò)散法[12]對初步分離得到的產(chǎn)物進(jìn)行抑真菌實驗，供試病原真菌為水稻紋枯病菌、馬鈴薯晚疫病菌、辣椒灰霉病菌、馬鈴薯早疫病菌和須毛癬菌。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均為3次獨立試驗平均值，采用Microsoft Excel 2007對原始試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，所得實驗數(shù)據(jù)采用方差分析(ANOVA)，并用Duncan法對各測定數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株He14發(fā)酵液對不同病原真菌的抑菌能力

試驗結(jié)果表明，菌株He14的發(fā)酵液對6株植物病原真菌和2株動物病原真菌的生長均有抑制作用(表1，圖1)。在植物病原真菌中，發(fā)酵液對馬鈴薯晚疫病菌的拮抗作用最強(qiáng)，抑制率為100%；對辣椒疫霉菌的拮抗作用相對較弱，抑制率為81%；對水稻紋枯病菌、水稻稻瘟病菌、煙草黑脛病菌和馬鈴薯早疫病菌的抑制率在50%～75%。對動物病原真菌須毛癬菌和紅色毛癬菌的拮抗強(qiáng)度相同，抑制率均為75%。綜合抑制率與病原真菌的生長速度考慮，選擇辣椒灰霉病菌作為菌株He14抗真菌活性實驗的指示菌用于后續(xù)實驗。

表1 菌株He14對病原真菌的抑制作用Table 1 Inhibitory effects of strain He14 on pathogenic fungi

注：A-水稻稻瘟病菌；B-煙草黑脛病菌；C-馬鈴薯早疫病菌；D-須毛癬菌；E-水稻紋枯病菌；F-紅色毛癬菌；G-辣椒灰霉病菌；H-馬鈴薯晚疫病菌。下同。

2.2 菌株He14發(fā)酵產(chǎn)物抑真菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性

實驗表明，菌株He14的發(fā)酵液在低溫及中高溫環(huán)境抑制率為76%～79%，在120 ℃下處理1 h后抑制率為71%，說明發(fā)酵液中活性成分具有一定的熱穩(wěn)定性；發(fā)酵液在pH 3～11環(huán)境下處理2 h后對供試病原真菌的抑制率可維持在70%～81%，在pH 1和pH 13時抑制率下降，為53%～59%；發(fā)酵液在紫外環(huán)境下處理30 ～180 min后抑制率維持在78%左右，與未經(jīng)紫外照射的對照組相比抑制率基本不變，說明菌株He14發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)具有紫外穩(wěn)定性(圖1～圖3)。

圖1 溫度對菌株He14發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.1 Effect of temperature on antibacterial activity of strain He14 fermentation broth

2.3 不同富集方法對發(fā)酵液抑真菌活性成分的影響

試驗結(jié)果表明，發(fā)酵液經(jīng)萃取處理后，各有機(jī)層粗提物與各水層粗提物均有不同程度的抑真菌效果，同等濃度下各有機(jī)層與各水層的抑真菌效果均小于原液，且活性規(guī)律不明顯；AlCl3、FeSO4、Al2(SO4)3

圖2 pH值對菌株He14發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.2 Effect of pH on antibacterial activity of strain He14 fermentation broth

圖3 紫外對菌株He14發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.3 Effect of UV on antibacterial activity of strain He14 fermentation broth

均不能使發(fā)酵液變澄清，發(fā)酵液經(jīng)明礬處理后液體雖然可以澄清，但活性較原液大大降低，且沉淀物沒有抑真菌活性；大孔吸附樹脂可有效富集發(fā)酵液中的活性成分，其中LX-60型大孔吸附樹脂效果最好(表2～表5)。

表2 萃取實驗結(jié)果Table 2 Results of extraction

注：“-”表示未檢出。下同。

表3 發(fā)酵液加入絮凝劑后活性變化結(jié)果Table 3 Results on treatment by flocculant

表4 大孔吸附樹脂流出液抑真菌活性Table 4 Antifungal activities of effluent of resins

表5 大孔吸附樹脂洗脫液抑真菌活性Table 5 Antifungal activities of eluent of resins

2.4 抑真菌活性產(chǎn)物的篩選

活性粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析后得到不同的混合組分。抑真菌活性實驗結(jié)果表明混合組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ顯示出了抑真菌活性(表6)。其中組分Ⅱ?qū)┰嚥≡婢纳L均有抑制效果，組分Ⅰ對水稻紋枯病菌、馬鈴薯晚疫病菌、辣椒灰霉病菌有抑制作用，組分Ⅲ對馬鈴薯晚疫病菌、辣椒灰霉病菌和須毛癬菌有抑制作用。

另外，病原真菌給藥處理持續(xù)培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，組分Ⅱ不僅對馬鈴薯晚疫病菌的生長有較強(qiáng)的抑制作用，還可令已生長的馬鈴薯晚疫病菌菌絲死亡(圖4)。

表6 混合組分Ⅰ, Ⅱ和Ⅲ對病原真菌的抗菌譜Table 6 Antifungal spectrum of compoundⅠ，Ⅱ and Ⅲ against pathogenic fungi

注：-表示無抑菌活性；+表示弱抑菌活性；++表示中等抑菌活性；+++表示強(qiáng)抑菌活性；I-水稻紋枯病菌。

A-培養(yǎng)7 d；B-培養(yǎng)10 d圖4 混合組分對馬鈴薯晚疫病菌抑制效果Fig.4 Inhibitory effect of components onPhytophthora infestans注：a為組分Ⅰ; c為組分Ⅱ; b與d為空白對照組。

3 討論

目前對賴氨酸芽孢桿菌的研究表明，其產(chǎn)生的活性物質(zhì)主要有蛋白酶類[13]、多糖類[14]、表面活性劑[15-16]等。曾承露等[17]運用響應(yīng)面法對賴氨酸芽孢桿菌P-3產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，使該菌產(chǎn)生胞外多糖的平均產(chǎn)量提高到2.92 g/L。王偉高等[18-20]從小鼠體內(nèi)分離得到1株可產(chǎn)氨基甲酸乙酯水解酶的賴氨酸芽孢桿SC02，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化后，該菌株最高酶活水平可達(dá)到7 066 U/L。PARK等[16]從賴氨酸芽孢桿菌KMC003中分離出螺環(huán)戊烯酮、螺菌毒素，但未進(jìn)行活性測定。SINGH等[10]對賴氨酸芽孢桿菌B-CM18進(jìn)行廣譜抗菌測定，發(fā)現(xiàn)該菌株對多種植物病原真菌有拮抗性并分離到了抗菌活性物質(zhì)——幾丁質(zhì)酶，但并未加入動物病原真菌。

本研究不僅測定了常見的植物病原真菌，還測定了對人類有感染性的動物病原真菌，豐富了賴氨酸芽孢桿菌的抗真菌譜。研究發(fā)現(xiàn)該菌株的活性物質(zhì)具有良好的穩(wěn)定性，為后期分離純化工作奠定了基礎(chǔ)。以抑真菌活性結(jié)果為指導(dǎo)，相比較于萃取和沉淀處理發(fā)酵液，使用大孔吸附樹脂能有效富集He14發(fā)酵液的抗真菌活性物質(zhì)。對活性粗產(chǎn)物進(jìn)行初步分離，得到有抑真菌活性的混合組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，其中組分Ⅱ抑真菌效果最強(qiáng)，且可令已生長的馬鈴薯晚疫病菌菌絲死亡，說明該組分可深入研究其抑真菌機(jī)制，以期發(fā)揮其在生物防治方面的潛力。