吳振，李紅，王勇德，譚紅軍，楊勇*，詹永，王福強

1(重慶市中藥研究院，中藥健康學(xué)重慶市重點實驗室，重慶,400065)2(重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶,401121)3(四川省廣元市旺蒼縣農(nóng)業(yè)局，四川 廣元,628200)

藍莓(VacciniumcorymbosumL.)屬于杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium)藍漿果亞屬(Cyanococcus)小漿果植物的果實。2017年中國藍莓種植面積已經(jīng)達到46 000 hm2，果實產(chǎn)量達到11.5萬t，約占世界總產(chǎn)量的第6位。藍莓富含多酚、黃酮、花色苷和原花青素等功效成分，大量攝入能預(yù)防癌癥、心臟病、中風(fēng)、肥胖及其相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生，營養(yǎng)價值普遍高于柑橘、葡萄等大宗水果[1-2]；聯(lián)合國糧農(nóng)組織將其列為五大健康食品之一，被稱為“世界第3代水果之王”。2018年研究發(fā)現(xiàn)，長期食用富含藍莓膳食(24 g/d，相當于一杯鮮藍莓果汁，90 d)可有效改善老年人的行動和認知能力[7]。

目前，藍莓仍以鮮食為主，約占總產(chǎn)量的75%。藍莓屬小漿果，果實采后易變軟腐爛，如對采后藍莓及時進行深加工，則便于其保藏和食用[8]。藍莓粗加工仍多以冷藏或凍藏為主，均可導(dǎo)致營養(yǎng)成分嚴重流失，限制其深加工利用[9-10]。同時由于藍莓種植的季節(jié)性限制，尋找保留、保護和穩(wěn)定藍莓活性成分的潛在方法(或深加工技術(shù))已成為解決藍莓收購季節(jié)短、易腐爛(同時導(dǎo)致農(nóng)戶難以銷售)的問題，同時也是提高附加值、促進藍莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵[11-12]。市場已有的鮮榨藍莓果汁、藍莓果汁飲料、藍莓乳飲料等產(chǎn)品頗受消費者歡迎，但藍莓產(chǎn)品在加工過程中涉及到高溫、pH值、空氣和光照等會加速生物活性成分(如多酚和原花青素等)的降解，導(dǎo)致藍莓產(chǎn)品保健功效下降、口感降低以及其他負面影響，如何解決這一問題成為制約藍莓果汁飲品發(fā)展的瓶頸。熱處理是果汁加工中的關(guān)鍵工序，能夠使果汁中的酶失活，破壞其中的微生物及致病菌，對提高果汁的安全性和保質(zhì)期具有重要的作用[13-14]。一般來說，低酸性果汁(pH>4.6)的熱處理溫度需高于100 ℃，才能實現(xiàn)“滅菌”，而酸性果汁(pH值<4.6)僅需要100 ℃以下的熱處理[15]。熱殺菌處理的溫度和時間是控制果汁的安全性、保質(zhì)期和品質(zhì)的重要因素。LANGER等[16]通過代謝組學(xué)研究藍莓全果與藍莓果汁對人體藍莓代謝產(chǎn)物的影響，9名健康受試者食用了250 g新鮮藍莓或等量藍莓果汁，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者有著相似的代謝特征。目前，對藍莓果汁在熱處理過程中品質(zhì)和抗氧化成分的變化未見報道。因此，研究不同熱處理溫度對藍莓果汁在冷藏過程中其主要功效成分(即總多酚、總黃酮、花色苷和原花青素)含量的影響，以及應(yīng)用動力學(xué)模型預(yù)測熱殺菌藍莓果汁在冷藏過程中其主要功效成分的變化規(guī)律，為藍莓果汁殺菌溫度的選擇、冷藏特性及其品質(zhì)綜合分析提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮藍莓，購買于當?shù)爻?品種為高叢藍莓安娜，VacciniumcorymbosumL.vs Anna)，可溶性固形物為(9.50±0.16)°Brix、可滴定酸為(2.28±0.42)%和pH值為2.91±0.01。

沒食子酸(gallic acid，GAE)、蘆丁(rutin)、矢車菊素-3-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-glucoside，COG)和兒茶素(catechin，Cat)，美國Sigma-Aldrich公司；普通化學(xué)試劑(分析純)，成都科龍試劑廠。

UV-2450紫外可見分光光度計，日本島津公司；JYL-C022E九陽料理機，九陽股份有限公司；DK-8D電熱恒溫水浴鍋，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同溫度殺菌處理的藍莓果汁及其制備方法

藍莓果汁的制備方法：藍莓→清洗→打漿、均質(zhì)處理(100 g藍莓)→裝袋→熱殺菌→4 ℃貯藏保存，具體如圖1所示。將已處理的藍莓果汁采用高溫塑料瓶封口(50 mL/瓶)，然后于60、70、80、90 ℃分別殺菌30 min，殺菌后立即進行恒溫貯藏試驗(4±0.5 ℃)，分別于0、1、2、4、6、8、10、12、14、16周取樣分析。

圖1 藍莓果汁制備過程及不同溫度熱處理的樣品Fig.1 The prepared procedure and samples of different thermal-treated blueberry juice

1.2.2 藍莓果汁中主要功效成分測定方法

(1)前處理方法：取10 g藍莓果汁，加入100 mL 75%乙醇(體積分數(shù))，超聲提取30 min(功率70 W)，5 000 r/min條件下離心10 min(4 ℃)，將上清液置于-4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)總多酚含量測定：采用Folin-Ciocalteu法測定[17]。取0.4 mL樣液加入2 mL Folin-Ciocalteu試劑，反應(yīng)5 min后，加入1.8 mL Na2CO3溶液(75 g/L)，常溫下避光反應(yīng)1 h后，以蒸餾水為空白對照，測定吸光值A(chǔ)765 nm；以GAE乙醇溶液(100～300 mg/L)做標準曲線，藍莓果汁中總多酚含量以每100 mg新鮮果汁中含有的GAE當量來表示(mg GAE/100 mgFw)。

(3)總黃酮含量采用三氯化鋁比色法測定[18]，取0.05 mL樣液，依次加入0.5 mL蒸餾水、0.04 mL 50 g/L Na2CO3溶液，搖勻，待5 min后加入0.04 mL 100 g/L Al(NO3)3溶液，定容至1 mL。在室溫下反應(yīng)15 min后于510 nm處測定吸光值?？傸S酮含量以每100 g新鮮果汁含有的蘆丁當量來表示(mg Rutin/100 gFw)。

(4)花色苷含量采用pH值示差法測定[19]，樣品分別用pH 1.0的KCl(0.025 mol/L，采用0.2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH)緩沖液和pH 4.5的CH3COONa(0.4 mol/L)稀釋相同的倍數(shù)，混勻，室溫下避光靜置30 min，測定每個樣品在520和700 nm波長下的吸光值，藍莓果汁中花色苷含量以每100 g新鮮果汁含有的COG當量來表示(mg COG/100 gFw)，按公式(1)計算：

(1)

式中：A，吸光度，A=(A510-A700)pH 1.0-(A510-A700)pH 4.5；MW，COG的相對分子質(zhì)量(449.2 g/mol)；DF，新鮮藍莓果汁樣品的稀釋倍數(shù)；ε，COG的摩爾消光系數(shù)(26900 L/(mol·cm))。

(5)原花青素含量采用香草醛-鹽酸法測定[20]，取0.05 mL樣品液，依次加入0.05 mL蒸餾水、0.6 mL 4%香草醛甲醇溶液、0.3 mL濃HCl，于20 ℃水浴中反應(yīng)30 min，測定500 nm處的吸光值。藍莓果汁中原花青素含量以每100 g新鮮果汁含有的Cat當量表示(mg Cat/100 g Fw)。

1.2.3 降解動力學(xué)評價方法

(1)果汁中絕大多數(shù)營養(yǎng)成分在貯藏過程中均會發(fā)生降解，其降解基本符合零級或一級反應(yīng)動力學(xué)模型[21-22]。分別采用零級、一級動力學(xué)和“零級+一級”結(jié)合動力學(xué)模型擬合藍莓果汁中總多酚、總黃酮、花色苷和原花青素變化，如公式(2)、(3)和(4)所示：

零級反應(yīng)：C=C0+(-k0)t

(2)

一級反應(yīng)：C=C0×exp(-k1×t)

(3)

“零級+一級”結(jié)合動力學(xué)模型：C=k0/k1-(k0/k1-C0)×exp(-k1×t)

(4)

式中：C，各成分的含量[mg/(100)gFw)]；C0，各成分的初始含量；k0和k1，分別為各成分的零級和一級反應(yīng)降解速率常數(shù)(w-1)；t，貯存時間(周)。將各個功效成分評價指標的冷藏時間和對應(yīng)的功效成分含量分別代入零級反應(yīng)和一級反應(yīng)方程式中，作C—t圖并進行動力學(xué)方程擬合，得到各個動力學(xué)模型方程及其擬合曲線。

(2)根據(jù)藍莓果汁熱處理溫度(T)對其功效成分降解速度常數(shù)(k)的影響，采用阿倫尼烏斯(Arrhenius)計算各成分在降解過程中的熱力學(xué)參數(shù)，如公式(5)所示。

(5)

式中：k，藍莓果汁主要功效成分的降解速率常數(shù)(w-1)；Ea，活化能(kJ/mol)；k0，頻率因子；R，通用氣體常數(shù)(8.314 J/(mol·K))；T，熱殺菌處理的絕對溫度(K)；將各個功效成分熱處理的1/T和最優(yōu)動力學(xué)擬合方程所得的k值分別代入公式(5)，作k—1/T圖并計算擬合參數(shù)。

(3)測定16個藍莓果汁熱處理樣品(每個溫度4個樣品)在冷藏過程中其總多酚、總黃酮、花色苷、原花青素含量，采用最佳動力學(xué)模型預(yù)測藍莓果汁在16 周冷藏過程中總多酚、總黃酮、花色苷、原花青素含量變化，通過分析測定值和預(yù)測值的線性關(guān)系，進而判斷預(yù)測效果。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

(6)

式中：RSS，殘差平方和；N，數(shù)據(jù)個數(shù)；Cpred，i，預(yù)測指標成分含量；Cexp，i，實測指標成分含量。

(7)

各試驗數(shù)據(jù)結(jié)果均以平均值±SD(n=3)表示，采用SPSS 15軟件(SPSS Inc.,Chicago,IL)進行方差分析，采用Origin 8.5軟件(Origin Lab Corporation,USA)進行數(shù)據(jù)擬合，采用LSD法進行多重比較，P<0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同熱殺菌溫度對藍莓果汁在冷藏過程中多酚和黃酮含量的影響

不同熱殺菌溫度(60～90 ℃)處理的藍莓果汁在4 ℃條件下貯藏16周過程中總多酚和總黃酮含量的變化曲線如圖2-A和圖2-B所示。未經(jīng)過熱殺菌處理的鮮藍莓果汁的總多酚和總黃酮含量分別為(249.5±7.8)mg GAE/(100 g)Fw、(427.1±9.3)mg Rutin/(100 g)Fw。經(jīng)60、70、80和90 ℃處理30 min的藍莓果汁在4 ℃條件下貯藏16周后，其總多酚和總黃酮保留率分別為73.62%、71.59%、68.43%、68.72%和68.53%、65.78%、67.47%、69.67%，其中溫度對總黃酮保留率的影響不顯著(P>0.05)；與經(jīng)60 ℃殺菌的藍莓果汁相比，經(jīng)70、80和90 ℃處理30 min的藍莓果汁的總多酚和總黃酮損失率分別為1.90%、3.49%、6.75%和3.26%、7.89%、12.68%；熱殺菌處理的藍莓果汁在貯藏初始階段其總多酚和總黃酮迅速下降，10周之后逐漸趨于平穩(wěn)；溫度越高，貯藏初始階段其總多酚和總黃酮下降越明顯。近年來，流行病學(xué)研究表明食用富含多酚和黃酮的食品能夠預(yù)防疾病[24-25]；多酚和黃酮是藍莓果汁中重要的抗氧化成分，藍莓果汁飲料的開發(fā)和應(yīng)用主要難點在于，如何防止多酚和黃酮類成分的氧化和降解、提高其保留率[11-12]。

不同熱處理溫度對藍莓果汁中花色苷和原花青素含量的影響如圖2-C和圖2-D所示。未經(jīng)過熱殺菌處理的鮮藍莓果汁的花色苷和原花青素含量分別為(169.7±9.3)mg COG/(100 g)Fw、(101.2±5.9)mg Cat/(100 g)Fw。經(jīng)60、70、80和90 ℃處理30 min的藍莓果汁在4 ℃條件下貯藏16周后，其花色苷和原花青素保留率分別為55.06%、53.41%、52.20%、57.43%和63.42%、62.98%、64.06%、65.51%。與經(jīng)60 ℃處理樣品相比，經(jīng)70、80和90 ℃處理30 min的藍莓果汁的花色苷和原花青素損失率分別為4.37%、12.41%、25.99%和3.33%、8.71%、12.52%；60和70 ℃熱殺菌對藍莓果汁中花色苷和原花青素影響不顯著(P>0.05)，而高溫處理(>70 ℃)花色苷和原花青素含量的變化影響較大；并且與總多酚和總黃酮相比，熱處理后花色苷和原花青素損失更大。經(jīng)60和70 ℃處理的藍莓果汁的花色苷和原花青素含量在10 周之后趨于平穩(wěn)，而經(jīng)80和90 ℃處理的藍莓果汁的花色苷和原花青素含量在8周之后就趨于平穩(wěn)。同時結(jié)果顯示，60 ℃低溫殺菌處理可有效減緩藍莓果汁中活性成分的損失，提高其保留率。通常鮮榨果汁富含原花青素和其他多酚類物質(zhì)，而商業(yè)殺菌果汁中發(fā)現(xiàn)的原花青素和多酚含量相對較低[26-27]；主要有2個方面的原因：(1)大多數(shù)商業(yè)殺菌果汁都是經(jīng)過稀釋的；(2)一般商業(yè)殺菌果汁均需要經(jīng)過破碎、加熱、酶處理、壓榨、熱殺菌、澄清、過濾等各種復(fù)雜的加工處理，導(dǎo)致花色苷和多酚類物質(zhì)被氧化降解或破壞，從而降低花色苷和多酚類物質(zhì)的含量[10,28]。通過測定不同熱殺菌處理的藍莓果汁在冷藏過程中的主要活性成分的變化，結(jié)果表明，鮮榨藍莓果汁經(jīng)過60 ℃低溫殺菌處理，冷藏16 周后其功效成分含量損失可以接受。VEGARA等[13,29]研究發(fā)現(xiàn)，低溫殺菌結(jié)合制冷有助于降低商業(yè)殺菌石榴汁中原花青素的降解，避免對其顏色產(chǎn)生顯著影響，并保留了該類生物活性物質(zhì)對人體健康的有益作用。目前，市場上鮮榨藍莓果汁較多，而冷藏類藍莓果汁產(chǎn)品較少，采用60 ℃低溫殺菌+4 ℃冷藏，既能保持鮮榨果汁產(chǎn)品良好的營養(yǎng)，又能延長保質(zhì)期。經(jīng)60 ℃低溫殺菌+4 ℃冷藏處理的藍莓果汁可作為一種冷藏型飲料，具有工業(yè)應(yīng)用和市場推廣價值。

A-總多酚；B-總黃酮；C-花色苷；D-原花青素圖2 不同熱處理溫度對藍莓果汁冷藏過程中總多酚、總黃酮、花色苷和原花青素降解的影響Fig.2 The effect of different thermal-treated temperatures on degradation of total polyphenols,total flavonoids,anthocyanin and proanthocyanidins of blueberry juice during cold storage注：圖中曲線均為采用聯(lián)合動力學(xué)方程擬合。

2.2 藍莓果汁總多酚、總黃酮、花色苷、原花青素?zé)峤到鈩恿W(xué)研究

表1 藍莓果汁在冷藏過程中總多酚、總黃酮、花色苷和原花青素的降解動力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetic parameters for the degradation of total polyphenols,total flavonoids,anthocyanin and proanthocyanidins of blueberry juice during cold storage

續(xù)表1

指標熱殺菌溫度/℃零級動力學(xué)一級動力學(xué)“零級+一級”結(jié)合動力學(xué)模型C0k0RSSR2AdjC0k1RSSR2AdjC0k0k1RSSR2AdjEa/(kJ·mol-1)花色苷60148.74.76139.460.8700153.10.0421.120.9304160.814.820.18000.5140.998170140.84.56362.30.8888145.40.045334.100.9391154.413.270.17641.2000.997680125.24.15671.40.8205130.50.048141.600.8954140.715.080.21630.5120.998590103.22.67639.990.7434106.70.058928.830.8150118.315.550.22881.1370.991712.73原花青素6083.151.84240.330.864485.00.028728.250.905091.38.240.1553.1720.98787083.832.11748.340.958484.70.03529.630.974587.67.440.14742.2140.99788074.501.678136.40.889375.50.039103.60.915980.812.180.23472.7080.99759075.951.664226.30.860576.40.0475185.70.885678.616.360.31674.3670.996916.42

2.3 “零級+一級”結(jié)合動力學(xué)模型應(yīng)用于預(yù)測藍莓果汁在冷藏期間功效成分含量

A-總多酚；B-總黃酮；C-花色苷；D-原花青素圖3 測定值和“零級+一級”結(jié)合動力學(xué)模型預(yù)測值的線性擬合Fig.3 The linear fitting curves of experimental values and predicted values obtained from combined model of “zero- and first-order”

零級和一級動力學(xué)被廣泛應(yīng)用于果汁的維生素和多酚類物質(zhì)的降解過程，其中鮮切果蔬及果汁中Vc的降解符合零級或一級動力學(xué)模型已成為共識[30]，而多酚類物質(zhì)降解情況則較為復(fù)雜。曹雪丹等[31]研究了藍莓果汁花色苷熱降解動力學(xué)及抗壞血酸對其熱穩(wěn)定性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)花色苷的降解呈現(xiàn)二級反應(yīng)動力學(xué)特征。ZHENG等[21]分別采用零級、一級動力學(xué)、Weibull和偏最小二乘回歸(partial least squares regression,PLSR)模型擬合和預(yù)測熱殺菌菠蘿汁在貯藏過程中總多酚含量及抗氧化活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同的預(yù)測模型均可以準確地描述果汁貯藏過程中總多酚含量及抗氧化活性的具體變化。ROIDOUNG等[32]在研究巴氏殺菌越橘果汁貯藏過程中發(fā)現(xiàn)了可預(yù)測其花色苷變化的模型，不僅引入了創(chuàng)新的統(tǒng)計技術(shù)來提高參數(shù)之間的高度相關(guān)性，而且提出了預(yù)測的經(jīng)驗?zāi)Ｐ汀Ｒ虼?，選擇最合適的模型對預(yù)測果汁在貯藏過程中的營養(yǎng)成分變化具有重要意義。本研究建立的“零級+一級”結(jié)合動力學(xué)預(yù)測模型可應(yīng)用于藍莓果汁在貯藏過程中主要活性成分總多酚、總黃酮、花色苷、原花青素在熱降解過程的預(yù)測和分析。

3 結(jié)論

通過測定不同溫度殺菌處理的藍莓果汁在冷藏16周過程中多酚和黃酮含量變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著熱殺菌溫度的升高，初始藍莓果汁中總多酚、總黃酮、花色苷和原花青素含量均呈現(xiàn)不同程度的降低，其中花色苷降低最為顯著；藍莓果汁在16周貯藏過程中活性成分含量均明顯下降，冷藏期活性成分降解狀況與熱殺菌溫度呈正相關(guān)；且經(jīng)高溫處理后其活性成分降解量增加，各功效成分熱降解更符合“零級+一級”結(jié)合動力學(xué)模型，該結(jié)合動力學(xué)模型可作為熱殺菌藍莓果汁在冷藏中功效成分降解的預(yù)判方式。60 ℃低溫殺菌+4 ℃冷藏有利于藍莓果汁功效成分的保留，可作為產(chǎn)品生產(chǎn)的指導(dǎo)方法。后續(xù)將繼續(xù)研究添加物(如食品抗氧化劑及其他飲料基質(zhì)成分等)對熱殺菌藍莓果汁在冷藏中品質(zhì)的影響，全面揭示影響熱殺菌藍莓果汁的內(nèi)外因素，提高藍莓果汁品質(zhì)和保質(zhì)期。