董建輝，田巧基,2，段素芳,2，劉義鳳,2，李海枝,2，夏凱,2*

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100015)2(功能主食創(chuàng)制與慢病干預(yù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100015)

近年來，膳食結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致糖尿病、脂肪肝、心血管疾病等慢病發(fā)病率在全球不斷攀升[1]。臨床研究顯示，慢病的發(fā)生與氧化應(yīng)激有密不可分的聯(lián)系，氧化應(yīng)激導(dǎo)致的肺纖維化造成了肺組織順應(yīng)性減退，彌散功能降低，最終導(dǎo)致患者出現(xiàn)難治性呼吸困難，嚴(yán)重危害人類生命健康[2-6]。因此調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平具有降低疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)和管理疾病的重要作用[7]。

燕窩作為一種歷史悠久的保健食材，美容養(yǎng)顏、潤肺生津[8-9]。早在唐朝，燕窩已深受宮廷貴族的青睞，現(xiàn)代研究表明，燕窩中豐富的生物活性成分葡萄糖胺、乳鐵蛋白、唾液酸、氨基酸、脂肪酸、維生素、礦物質(zhì)和抗氧化劑等具有抗炎、抗氧化及強(qiáng)化骨骼的作用[8,10-14]。更有研究證明，燕窩提取物可通過調(diào)節(jié)肝臟抗氧化和炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，對高脂飲食誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥有一定的抑制作用[15-17]。

皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的基本方式是通過傷后再生的細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì)填充、連接或代替損傷組織，因此細(xì)胞增生是創(chuàng)傷修復(fù)的重要過程[18]。皮膚衰老是由于表皮角質(zhì)形成對細(xì)胞生長和更新速度減慢，膠原和彈性纖維合成能力下降，表皮和真皮變薄導(dǎo)致皮膚拉伸后彈性恢復(fù)力減弱。因此，在皮膚松弛、皮膚損傷修復(fù)、抗老化過程中，表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的生長、分化至關(guān)重要。燕窩中的活性成分具有促表皮角質(zhì)形成細(xì)胞生長的能力。但是傳統(tǒng)燕窩的加工一般采用高溫?zé)踔蟮姆绞?，往往伴隨燕窩中的有效成分熱損失，采用低溫鮮燉加工工藝生產(chǎn)的“95°鮮燕窩”，可使細(xì)胞中的活性成分得到有效保留。H2O2是一種強(qiáng)氧化劑，易于穿透細(xì)胞膜，與胞內(nèi)Fe3+反應(yīng)形成自由基，導(dǎo)致胞內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及DNA損傷[19-21]。本研究選取H2O2誘導(dǎo)MRC-5細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型比較傳統(tǒng)工藝制作的燕窩與“95°鮮燕窩”的抗氧化能力；并通過Hacat細(xì)胞初步探究了2種燕窩提取提取物物及燕窩肽促進(jìn)皮膚角質(zhì)細(xì)胞(Hacat)生長能力的差別。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MRC-5細(xì)胞、Hacat細(xì)胞，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所；傳統(tǒng)工藝加工燕窩，實(shí)驗(yàn)室制備；“95°鮮燕窩”、燕窩肽，玖拾五度鮮生物科技有限公司提供；MEM(modified eagle medium)培養(yǎng)基、MEM(含NEAA)培養(yǎng)基、平衡鹽緩沖液(Hank’s balanced salt solution，HBSS)，中科邁晨科技有限公司；胎牛牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)，美國Gibco；Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒、2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2,7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)，胰蛋白酶，RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

生物安全柜，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；CO2培養(yǎng)箱，松下公司；倒置生物顯微鏡(CKX41)，奧林巴斯公司；分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；pH計(jì)，上海雷磁儀器廠；Spectra Max酶標(biāo)儀(i3)，MD公司；超聲波清洗儀(KQ-250DE)，昆山超聲儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)(GL-20G-Ⅱ型)，上海安亭科學(xué)儀器廠；冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品提取

分別取75 g “95°鮮燕窩”和傳統(tǒng)燕窩加入適量的水混勻后剪切10 min，于高速冷凍離心機(jī)7 500 r/min，4 ℃條件下離心10 min，取上清于50 mL離心管中，放入冷凍干燥機(jī)進(jìn)行凍干，凍干后回收樣品水提物進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞的體外培養(yǎng)

1.3.2.1 MRC-5細(xì)胞的培養(yǎng)

MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%FBS、青霉素100 U/mL和鏈霉素100 U/mL的MEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、含5%CO2以及90%相對濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2.2 Hacat細(xì)胞的培養(yǎng)

Hacat細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%FBS、青霉素100 U/mL和鏈霉素100 U/mL的MEM(NESS)培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件同1.3.2.1。

1.3.3 MRC-5氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的構(gòu)建

1.3.3.1 H2O2的CCK-8細(xì)胞毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)

取96孔培養(yǎng)板，每孔加100 μL細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，37 ℃培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，用HBSS清洗一次，每孔加入50、100、150、200、250、300、400、500 μmol/L 8個(gè)不同濃度H2O2100 μL，以無H2O2的相同培養(yǎng)基孵育細(xì)胞為對照，培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液于37 ℃避光孵育2 h。用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度。以對照組細(xì)胞的細(xì)胞存活率為100%計(jì)算其余組別細(xì)胞存活率。

1.3.3.2 氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的構(gòu)建

選取對細(xì)胞生長無顯著影響的H2O2濃度誘導(dǎo)氧化應(yīng)激細(xì)胞模型，各組細(xì)胞加樣處理24 h后，小心棄去培養(yǎng)液，用HBSS洗1次，用RIPA裂解液裂解30 min后，按試劑盒說明書步驟測定細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-PX水平。各組細(xì)胞加樣處理24 h后，小心棄去培養(yǎng)液，HBSS洗1次，加入25 μmol的DCFH-DA作用30 min，吸出DCFH-DA用HBSS洗2次，每孔加入300 μL胰酶消化5 min后，用700 μL完全培養(yǎng)基終止消化，吹打均勻后用流式細(xì)胞儀測定熒光強(qiáng)度。結(jié)果以模型組ROS含量的百分比表示(%)。

1.3.4 燕窩水提物及燕窩肽對MRC-5細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的預(yù)保護(hù)作用

1.3.4.1 燕窩水提物及燕窩肽的CCK-8細(xì)胞毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)

分別選取200、400、500、600、800、1 000 μg/mL 5個(gè)不同濃度的燕窩水提物及燕窩肽測定3種樣品對MRC-5細(xì)胞增殖的影響，實(shí)驗(yàn)方法同1.3.3.1。

1.3.4.2 實(shí)驗(yàn)分組

在建立的氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上觀察兩種燕窩水提物及燕窩肽對氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞產(chǎn)生的預(yù)保護(hù)作用。

將細(xì)胞以3.5×106個(gè)/mL的濃度接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁并長滿時(shí)，用HBSS潤洗細(xì)胞一次，加入不同的處理液。細(xì)胞分組為對照組：純培養(yǎng)基、模型組：300 μmol/L H2O2組以及模型組中提前加入各燕窩水提物孵育2 h的實(shí)驗(yàn)組(終濃度200～400 μg/mL)。細(xì)胞上樣前用HBSS緩沖液洗1次，上樣后37 ℃孵育24 h，測定各組的SOD、ROS、MDA、GSH-PX，測定方法同1.3.3.2。

1.3.5 燕窩水提物及燕窩肽對Hacat細(xì)胞增殖的影響

分別選取10、25、50、100、200、300、400、500 μg/mL 8個(gè)不同濃度的燕窩水提物及燕窩肽測定3種樣品對Hacat細(xì)胞增殖的影響，實(shí)驗(yàn)方法同1.3.3.1。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 MRC-5氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的構(gòu)建

2.1.1 H2O2對MRC-5細(xì)胞增殖的影響

如圖1所示，由于H2O2對細(xì)胞具有一定的損傷作用，隨著H2O2濃度的增加細(xì)胞存活率顯著下降。當(dāng)H2O2濃度達(dá)到250 μmol/L顯著抑制細(xì)胞生長(P<0.05)，H2O2達(dá)到400 μmol/L時(shí)，對細(xì)胞的抑制率大于50%，嚴(yán)重影響細(xì)胞的生長繁殖。因此后續(xù)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激模型實(shí)驗(yàn)中選擇上樣濃度為100、150、200、250、300 μmol/L。

圖1 不同濃度H2O2對MRC-5細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effects of different concentrations of H2O2 on the viability of MRC-5 cells注：*P<0.05(相對于對照組)。下同。

2.1.2 氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的構(gòu)建

ROS是氧化應(yīng)激的主要標(biāo)志物之一，產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷的主要原因是體內(nèi)生成的ROS超出了機(jī)體生理范圍量。ROS持續(xù)高濃度存在，會(huì)導(dǎo)致肺纖維化、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生。由圖2可知，H2O2處理24 h后，低濃度的H2O2會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)ROS含量降低，這說明當(dāng)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平較低時(shí)，能夠通過自身的抗氧化能力降低ROS含量，減輕氧化應(yīng)激對細(xì)胞帶來的損傷，但是隨著H2O2濃度不斷升高導(dǎo)致氧化應(yīng)激水平較高時(shí)，ROS含量就會(huì)超出自身調(diào)節(jié)的范圍就會(huì)并對細(xì)胞造成傷害。

圖2 H2O2處理對MRC-5細(xì)胞內(nèi)ROS的影響Fig.2 Effect of H2O2 treatment on ROS content in MRC-5 Cells

SOD是機(jī)體抗氧化的主要酶類之一，SOD活力也是判定化合物抗氧化能力的指標(biāo)之一。由圖3可知，H2O2處理24 h后，SOD活力呈先增加后降低的趨勢，這種趨勢與ROS的結(jié)果相一致，細(xì)胞出現(xiàn)輕度的氧化應(yīng)激時(shí)，能夠增加SOD的酶活力來緩解氧化應(yīng)激，從而減低對細(xì)胞帶來的損傷，但是當(dāng)氧化應(yīng)激超出自身調(diào)節(jié)的范圍時(shí)就會(huì)抑制SOD的酶活力，此時(shí)不斷增多的ROS對細(xì)胞造成損傷。

圖3 H2O2處理對MRC-5細(xì)胞內(nèi)SOD活力的影響Fig.3 Effect of H2O2 treatment on SOD activity in MRC-5 Cells

綜上所述，當(dāng)H2O2達(dá)到300 μmol/L時(shí)，ROS含量顯著增加(P<0.05)，SOD含量降低證明細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷，因此選擇300 μmol/L H2O2為最終造模濃度。

2.2 燕窩水提物及燕窩肽對MRC-5細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的預(yù)保護(hù)作用

2.2.1 燕窩水提物及燕窩肽對MRC-5細(xì)胞增殖的影響

由圖4可知，低濃度(600 μg/mL以下)的“95°鮮燕窩”水提物及燕窩肽促進(jìn)細(xì)胞生長，高濃度(800 μg/mL以上)“95°鮮燕窩”水提物及傳統(tǒng)燕窩提取物抑制細(xì)胞生長。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，3種樣品在200～400 μg/mL不影響MRC-5細(xì)胞生長活力，因此選擇此濃度范圍進(jìn)行后續(xù)的預(yù)保護(hù)實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 燕窩水提物及燕窩肽對MRC-5細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的預(yù)保護(hù)作用

由圖5可知，與對照組相比模型組ROS含量顯著增加(P<0.05)，表明MRC-5細(xì)胞出現(xiàn)了氧化應(yīng)激損傷。與模型組相比，“95°鮮燕窩”水提物和燕窩肽在200～400 μg/mL預(yù)處理2h能顯著降低ROS含量(P<0.05)，且隨著濃度的增加呈劑量依賴性降低胞內(nèi)ROS含量。傳統(tǒng)燕窩水提物在200 μg/mL對ROS含量無顯著影響，在300、400 μg/mL時(shí)呈劑量依賴性顯著降低ROS含量(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明3種樣品均能顯著降低ROS含量，“95°鮮燕窩”水提物在低濃度時(shí)能夠發(fā)揮較好的ROS清除能力。

MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化最重要的產(chǎn)物之一，它的生成表明細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷。由圖6可知，與對照組相比模型組MDA含量顯著增加(P<0.05)，表明模型組出現(xiàn)氧化應(yīng)激。與模型組相比，“95°鮮燕窩”水提物在400 μmol/L預(yù)處理2 h顯著降低MDA含量(P<0.05)，燕窩肽在300 μmol/L預(yù)處理2 h顯著降低MDA含量(P<0.05)。因此，“95°鮮燕窩”、燕窩肽能有效清除胞內(nèi)MDA，減輕細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，傳統(tǒng)燕窩水提物對MDA含量沒有顯著影響。

圖4 不同濃度燕窩及燕窩肽對MRC-5細(xì)胞活力的影響Fig.4 Effects of different concentrations of bird's nest extract and bird′s nest peptide on the viability of Mrc-5 cells

圖5 燕窩水提物及燕窩肽對MRC-5細(xì)胞內(nèi)ROS的影響Fig.5 Effects of bird's nest extract and bird′s nest peptide on ROS content in MRC-5 cells注：燕窩提取物及燕窩肽對MRC-5細(xì)胞內(nèi)ROS的影響 #P<0.05 vs對照組，*P<0.05 vs模型組

圖6 燕窩水提物及燕窩肽對MRC-5細(xì)胞MDA含量的影響Fig.6 Effects of bird′s nest extract and bird′s nest peptide on MDA content in MRC-5 cells

由圖7可知，與對照組相比模型組SOD活力顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，“95°鮮燕窩”水提物和燕窩肽在300、400 μmol/L預(yù)處理2 h能顯著增加SOD酶活力(P<0.05)，傳統(tǒng)燕窩水提物在400 μmol/L顯著增加SOD酶活力(P<0.05)。細(xì)胞內(nèi)SOD酶活力增加，表明細(xì)胞清除ROS、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的能力增強(qiáng)。因此兩種燕窩水提物及燕窩肽均能通過增加SOD酶活力改善氧化應(yīng)激，且與傳統(tǒng)燕窩水提物相比“95°鮮燕窩”水提物處理組增加SOD酶活力的能力更強(qiáng)，能更有效地改善氧化應(yīng)激損傷。

圖7 燕窩水提物及燕窩肽對MRC-5細(xì)胞內(nèi)SOD活力的影響Fig.7 Effects of bird′s nest extract and bird′s nest peptide on SOD activity in MRC-5 cells

GSH-PX是除SOD以外的另一類抗氧化酶，其活力能間接反應(yīng)機(jī)體的氧化應(yīng)激水平同時(shí)也可以判斷化合物的抗氧化能力。由圖8可知，與對照組相比模型組GSH-PX活力顯著降低(P<0.05)，“95°鮮燕窩”水提物在400 μmol/L預(yù)處理2 h，與模型組相比能顯著增加GSH-PX活力(P<0.05)，因此，“95°燕窩”水提物能通過增加GSH-PX活力減輕細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。傳統(tǒng)燕窩水提物與燕窩肽均能不同程度地增強(qiáng)GSH-PX活力但是與模型組相比無顯著性。

圖8 燕窩水提物及燕窩肽對MRC-5細(xì)胞GSH-PX活力的影響Fig.8 Effects of bird′s nest extract and bird′s nest peptide on the activity of GSH-PX in MRC-5 cells

肺是人體重要的呼吸器官，由于某些原因?qū)е碌姆螕p傷，使機(jī)體的氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡，最終引發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生氧化損傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡及組織損傷，促進(jìn)機(jī)體內(nèi)成纖維細(xì)胞趨化[22]。通過研究肺纖維化動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激水平顯著增高，相應(yīng)的抗氧化物明顯減少，表示氧化/抗氧化失衡可能在肺維化發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[2,9]。本研究通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，“95°鮮燕窩”水提物通過顯著增加SOD、GSH-PX酶活力(P<0.05)，進(jìn)而降低細(xì)胞ROS、MDA等氧化應(yīng)激標(biāo)志物的生成。傳統(tǒng)燕窩水提物能夠增加SOD酶活力，降低ROS含量；燕窩肽能夠增加SOD酶活力，降低胞內(nèi)ROS、MDA的含量。

2.3 燕窩水提物及燕窩肽對Hacat細(xì)胞增殖的影響

表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的生長、分化對皮膚損傷修復(fù)、抗老化至關(guān)重要[23]。圖9所示，不同濃度燕窩水提物及燕窩肽處理細(xì)胞24 h后對細(xì)胞增殖的影響，傳統(tǒng)燕窩水提物在100μmol/mL時(shí)顯著刺激細(xì)胞生長(P<0.05)，大于300 μmol/mL時(shí)顯著抑制細(xì)胞生長(P<0.05)。“95°鮮燕窩”在200μmol/mL時(shí)顯著刺激細(xì)胞生長(P<0.05)，燕窩肽在100 μmol/mL時(shí)顯著刺激細(xì)胞生長(P<0.05)。

圖9 不同濃度燕窩水提物及燕窩肽對Hacat細(xì)胞活力的影響Fig.9 Effects of different concentrations of bird′s nest extract and bird′s nest peptide on the viability of Hacat cells

如圖10所示，200 μmol/mL的“95°鮮燕窩”水提物顯著刺激Hacat細(xì)胞增殖，培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞密度大于傳統(tǒng)燕窩水提物及燕窩肽組。因此，“95°鮮燕窩”在200 μmol/mL時(shí)顯著刺激Hacat的生長分化(P<0.05)，說明其在皮膚損傷及抗衰老的過程中具有一定的功效。

3 結(jié)論與展望

研究通過氧化應(yīng)激細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)證實(shí)，燕窩及燕窩肽能夠通過增加SOD、GSH-PX酶活力，進(jìn)而降低胞內(nèi)ROS、MDA水平改善細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)并且這種保護(hù)作用存在劑量效應(yīng)關(guān)系，尤其是“95°鮮燕窩”水提物及燕窩肽作用效果顯著，由此推測燕窩的加工方式對其活性成分具有一定的影響。同時(shí)燕窩水提物均表現(xiàn)出促進(jìn)Hacat細(xì)胞的增殖作用，表明燕窩中的有效成分在抵抗皮膚松弛、皮膚損傷修復(fù)、抗老化過程中發(fā)揮作用。本研究僅在細(xì)胞水平上對燕窩的生理功能進(jìn)行了初步探索，由于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)本身具有一定的局限性，因此后續(xù)還需要進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。近年來大量研究數(shù)據(jù)表明慢病發(fā)生常伴隨氧化應(yīng)激出現(xiàn)，因此深入探究燕窩活性成分的抗氧化機(jī)制對于慢病防治具有深遠(yuǎn)的意義。

a-對照組;b-傳統(tǒng)燕窩水提物組;c-“95°鮮燕窩”水提物組;d-燕窩肽組圖10 燕窩水提物及燕窩肽(200 μmol/mL)對Hacat細(xì)胞活力的影響Fig.10 Effects of bird′s nest extract and bird′s nest peptide (200 μmol/mL)on the viability of Hacat cells