徐達(dá),梅漫莉,徐慶陽(yáng)1,2,*

1(代謝控制發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津,300457)2(天津市氨基酸高效綠色制造工程實(shí)驗(yàn)室，天津,300457)3(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津,300457)

L-纈氨酸是人體所必需的8種氨基酸之一，屬于分支鏈氨基酸，是用來(lái)合成各類抗體、激素以及酶等的原料，在人體內(nèi)有特殊的生理功能，是維持生命活動(dòng)的重要物質(zhì)[1-2]。任何高級(jí)生物都必須通過(guò)外源攝取的途徑來(lái)補(bǔ)充L-纈氨酸，因此，L-纈氨酸在氨基酸生產(chǎn)中具有重要地位[3-4]。在工業(yè)生產(chǎn)中，通常是以谷氨酸棒狀桿菌作為生產(chǎn)菌株，利用微生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)L-纈氨酸[5-10]。L-纈氨酸通常作為營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑添加至各類綜合氨基酸輸液及制劑中，其市場(chǎng)需求量呈逐年上升趨勢(shì)，然而，目前發(fā)酵法生產(chǎn)L-纈氨酸的產(chǎn)量仍未達(dá)到理想水平，無(wú)法滿足龐大的市場(chǎng)需求[11-12]。

膽堿[13]是所有生物膜的組成成分，同時(shí)作為乙酰膽堿的前體物質(zhì)，它在各類生物體的生長(zhǎng)發(fā)育中均起到了非常重要的調(diào)控作用，目前，氯化膽堿的添加在魚(yú)類養(yǎng)殖[14]、作物保護(hù)[14]、畜禽類增產(chǎn)[15-17]的方面皆起到了明顯的作用。在生物體內(nèi)，重金屬修飾、基因表達(dá)的調(diào)控、蛋白質(zhì)功能的調(diào)節(jié)以及RNA的加工都需要在酶的催化作用下進(jìn)行甲基化才能實(shí)現(xiàn)[18-21]。一分子氯化膽堿攜帶3個(gè)活性甲基基團(tuán)，在必要的時(shí)候能夠?qū)⒓谆峁┙o高半胱氨酸，合成谷氨酸棒狀桿菌生長(zhǎng)所必須的蛋氨酸，因此，氯化膽堿的外源添加對(duì)谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸必然會(huì)產(chǎn)生影響[21]。

為探究氯化膽堿在谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸過(guò)程中的作用，本研究從添加方式以及添加量2個(gè)方面出發(fā)，旨在驗(yàn)證外源添加氯化膽堿對(duì)于工業(yè)微生物菌體生長(zhǎng)產(chǎn)酸是否具有促進(jìn)作用，同時(shí)初步確定一種合適的添加方法，為谷氨酸棒狀桿菌工業(yè)化生產(chǎn)L-纈氨酸提供一個(gè)可行方案。

1 材料與方法

1.1 菌種

谷氨酸棒狀桿菌XV0505(Leu-+Ile-+2-TAr+α-ABr+SGr)，天津科技大學(xué)代謝工程研究室保藏菌種。

1.2 主要儀器與設(shè)備

SBA-40E生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所；5 L自動(dòng)控制發(fā)酵罐,上海保興生物設(shè)備工程有限公司;30 L自動(dòng)控制發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；KQ-C高壓蒸汽發(fā)生器，上海奉賢協(xié)新機(jī)電廠；Agilent1200高效液相色譜儀，Agilents Technologies；Agilent C18(15 mm×4.6 mm，3.5μm)，Agilents Technologies；HH-4恒溫水浴鍋，金壇市科學(xué)儀器廠；752分光光度計(jì)，上海分析儀器廠；SS-325全自動(dòng)滅菌鍋，日本TOMY儀器有限公司；OLYMPUS生物顯微鏡，日本OLYMPUS會(huì)社；FA2204B電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 培養(yǎng)條件[22]

1.3.1 保藏條件

于-80 ℃環(huán)境下，2.8 mol/L的丙三醇溶液中保藏。

1.3.2 活化培養(yǎng)基

牛肉膏10 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母粉10 g/L、玉米干粉10 g/L、NaCl 2.5 g/L、KH2PO51 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L。121 ℃滅菌20 min，制成試管斜面培養(yǎng)基以及200 mL茄型瓶培養(yǎng)基。

1.3.3 種子培養(yǎng)基

葡萄糖30 g/L、KH2PO51.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.4 g/L、VB10.3 mg/L、VH200 μg/L、玉米干粉20 g/L(121 ℃、20 min單獨(dú)滅菌)、豆粕水解液10 mL/L、酵母粉5 g/L、微量元素混合液1 mL/L、蛋氨酸1 g/L，115 ℃滅菌15 min。

1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖80 g/L、KH2PO52.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.8 g/L、VB10.2 mg/L、VH50 μg/L、玉米干粉16 g/L(121 ℃、20 min單獨(dú)滅菌)、豆粕水解液20 mL/L、微量元素混合液1 mL/L、谷氨酸5 g/L、亮氨酸 0.22 g/L、異亮氨酸 0.1 g/L、蛋氨酸 0.7 g/L。115 ℃滅菌15 min。

1.4 培養(yǎng)方法[22]

1.4.1 種子活化培養(yǎng)方法

將保藏于-80 ℃甘油管中的菌種涂布于試管斜面中，于32 ℃恒溫條件下培養(yǎng)24 h；利用接菌環(huán)將試管斜面上的菌落涂布于茄型瓶中，于32 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)24 h。

1.4.2 種子罐培養(yǎng)方法

用無(wú)菌水將茄型瓶中的菌體洗脫下來(lái)，接種于5 L發(fā)酵罐中并最終定容至3 L進(jìn)行種子培養(yǎng)，溫度32 ℃，初始轉(zhuǎn)速200 r/min，通風(fēng)量2.0 L/min，通過(guò)自動(dòng)流加氨水控制pH 7.0～7.2,以泡敵消泡,通過(guò)溶氧反饋調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速，使得溶氧水平保持在20%～30%，培養(yǎng)14 h左右，菌體生長(zhǎng)至OD600為22時(shí)接種2.5 L體積于30 L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵。

1.4.3 發(fā)酵罐培養(yǎng)方法

定容至13 L，溫度32 ℃，初始轉(zhuǎn)速200 r/min，通風(fēng)量0.5 m3/h，通過(guò)自動(dòng)流加氨水控制pH維持7.0～7.2，以泡敵消泡，通過(guò)溶氧反饋調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速，維持罐內(nèi)溶氧水平于20%左右，通過(guò)一定脈沖比進(jìn)行流加補(bǔ)糖，控制發(fā)酵液內(nèi)殘?zhí)菨舛缺３衷?0～15 g/L，培養(yǎng)時(shí)間52 h。

1.4.4 氯化膽堿梯度添加控制發(fā)酵

以氯化膽堿添加量作為變量，在不同批次發(fā)酵培養(yǎng)基底物中分別添加質(zhì)量濃度為0、0.3、0.5、1、2 g/L的氯化膽堿進(jìn)行培養(yǎng)，選擇最優(yōu)的濃度，在此基礎(chǔ)上采取氯化膽堿隨糖流加的方式，同時(shí)選擇在不同批次的流加糖中添加質(zhì)量濃度為0、0.3、0.5、1、2 g/L的氯化膽堿進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。

1.5 分析測(cè)定方法[23-25]

每間隔4 h取樣，用去離子水稀釋樣品20倍，在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定分光光度值，離心取上清液，利用SBA生物傳感分析儀測(cè)定發(fā)酵液內(nèi)的殘?zhí)?；電子天平稱重并記錄每4 h流加補(bǔ)糖的量；梅特勒電極在線實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)pH、DO、溫度，精密pH試紙(6.4～8.0)輔助矯正pH。高效液相色譜法分析測(cè)定氨基酸含量，采用Agilent C18色譜柱，衍生劑為2，4-二硝基氟苯，柱前衍生，有機(jī)相為50%的乙腈、無(wú)機(jī)相為4.1 g/L的乙酸鈉溶液，柱溫33 ℃，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)取3次實(shí)驗(yàn)的平均值。單因素方差分析之后Dunnett檢驗(yàn)來(lái)確定數(shù)據(jù)差異的顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 底物中氯化膽堿的不同添加量對(duì)發(fā)酵菌體量及產(chǎn)酸的影響

如圖1和圖2所示，在發(fā)酵培養(yǎng)基底料中添加了5個(gè)不同質(zhì)量濃度的氯化膽堿,測(cè)定了菌體在生長(zhǎng)過(guò)程中的密度變化以及產(chǎn)量增長(zhǎng)。隨著底物中氯化膽堿添加量的增加，菌體生長(zhǎng)速度也隨之增加，當(dāng)?shù)孜镏新然憠A添加質(zhì)量濃度提高至0.5 g/L以上時(shí)，菌體生長(zhǎng)速率變化不明顯，所有濃度添加下，最終菌體總量趨于一致，菌液最高OD600nm達(dá)到39.56；隨著底物中氯化膽堿添加濃度的增加，L-纈氨酸的產(chǎn)量也隨之增加，當(dāng)氯化膽堿添加量提高至0.5 g/L以上時(shí)，L-纈氨酸產(chǎn)量隨氯化膽堿添加量變化不明顯，最終維持在76 g/L左右。

圖1 不同氯化膽堿添加量對(duì)菌體OD影響Fig.1 The value of optical density under different contents of choline chloride

圖2 不同氯化膽堿添加量對(duì)L-纈氨酸產(chǎn)量的影響Fig.2 the production of L-valine under different contents of choline chloride

2.2 底物中氯化膽堿的不同添加量對(duì)菌體耗糖與糖酸轉(zhuǎn)化率的影響

在發(fā)酵結(jié)束之后，對(duì)不同氯化膽堿添加量的批次進(jìn)行耗糖速率與糖酸轉(zhuǎn)化率的測(cè)算，繪制耗糖速率曲線，見(jiàn)圖3。隨著底物中氯化膽堿添加量的增加，菌體耗糖速率加快，當(dāng)?shù)孜镏新然憠A添加量提高至0.5 g/L以上時(shí)，耗糖速率不再隨著氯化膽堿添加量增加而大幅增加，而是趨于穩(wěn)定；如表1所示，氯化膽堿添加量的不同對(duì)菌體糖酸轉(zhuǎn)化率的提高沒(méi)有很明顯的作用，糖酸轉(zhuǎn)化率依舊保持在36%左右。

圖3 不同氯化膽堿添加量對(duì)菌體耗糖的影響Fig.3 the glucose consumption under different contents of choline chloride

表1 不同氯化膽堿添加量下的糖酸轉(zhuǎn)化率Table 1 conversion rate of glucose and acid under different contents of choline chloride

注：表中累計(jì)耗糖量為已除去所含結(jié)晶水和溶劑水的葡萄糖含量。下同。

2.3 聯(lián)合流加補(bǔ)充氯化膽堿的不同添加量對(duì)發(fā)酵菌體量及產(chǎn)酸的影響

為探究是否在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中保持罐內(nèi)氯化膽堿濃度在一定值時(shí)最有利于發(fā)酵產(chǎn)酸及糖酸轉(zhuǎn)化率的提高，我們?cè)诎l(fā)酵中期開(kāi)始補(bǔ)糖的時(shí)候進(jìn)行隨糖流加一定濃度的氯化膽堿，并且同樣選擇了0、0.3、0.5、1、2 g/L五個(gè)質(zhì)量濃度的添加量，對(duì)比發(fā)酵過(guò)程中的菌體生長(zhǎng)密度變化以及目的氨基酸產(chǎn)物的增長(zhǎng)狀況(圖4、圖5)。發(fā)現(xiàn)，隨著氯化膽堿添加量的增加，菌體活力提高，菌體增長(zhǎng)速度加快，當(dāng)隨糖流加的氯化膽堿濃度達(dá)到1 g/L時(shí)，菌體增速達(dá)到峰值；L-纈氨酸的產(chǎn)量與氯化膽堿的流加濃度呈正比，當(dāng)隨糖流加的氯化膽堿質(zhì)量濃度達(dá)到1 g/L時(shí)，L-纈氨酸的產(chǎn)量也達(dá)到峰值，此時(shí)增加所流加氯化膽堿的濃度時(shí)，L-纈氨酸產(chǎn)量沒(méi)有明顯提高，基本維持在86 g/L左右。

圖4 不同氯化膽堿流加量對(duì)菌體OD的影響Fig.4 the value of optical density under different fed-batch contents of choline chloride

圖5 不同氯化膽堿流加量對(duì)L-纈氨酸產(chǎn)量的影響Fig.5 the production of L-valine under different fed-batch contents of choline chloride

2.4 聯(lián)合流加補(bǔ)充氯化膽堿的不同添加量對(duì)菌體耗糖與糖酸轉(zhuǎn)化率的影響

對(duì)不同濃度流加氯化膽堿的發(fā)酵批次進(jìn)行耗糖速率以及糖酸轉(zhuǎn)化率的統(tǒng)計(jì)測(cè)算，繪制曲線圖表，如圖6、表2所示。菌體的活力與流加氯化膽堿的濃度成正比，當(dāng)隨糖流加的氯化膽堿質(zhì)量濃度達(dá)到1 g/L時(shí)，菌體耗糖速率達(dá)到峰值；與在底糖中添加氯化膽堿情況相似，菌體發(fā)酵的最終糖酸轉(zhuǎn)化率沒(méi)有較大地提高，依舊穩(wěn)定在36%左右(表2)。

圖6 不同氯化膽堿流加量對(duì)菌體耗糖的影響Fig.6 the glucose consumption under different contents of choline chloride

2.5 氯化膽堿的添加對(duì)單位菌體產(chǎn)酸速率的影響

對(duì)未添加氯化膽堿的發(fā)酵批次與添加最適濃度的氯化膽堿的發(fā)酵批次進(jìn)行對(duì)比，計(jì)算其單位菌體每小時(shí)的產(chǎn)酸，繪制曲線，如圖7所示，氯化膽堿最適添加量下的發(fā)酵批次中，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的單位菌體產(chǎn)酸速率均高于未進(jìn)行添加的發(fā)酵批次，因此可見(jiàn)，氯化膽堿的添加有效提高了菌體的活力和產(chǎn)酸能力。

圖7 優(yōu)化前后單位菌體產(chǎn)酸對(duì)比Fig.7 Comparison of acid production per gram of bacteria before and after optimization

膽堿作為甲基供給的前體物，是參與磷脂、卵磷脂合成的重要物質(zhì)，同時(shí)還是乙酰膽堿的前體物，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生命活動(dòng)中起著非常重要的作用[26-27]。在畜禽、水產(chǎn)等養(yǎng)殖行業(yè)中向動(dòng)物飼料中添加適量的氯化膽堿，能夠有效提高產(chǎn)品產(chǎn)量與質(zhì)量，而在微生物的培養(yǎng)過(guò)程中，氯化膽堿的實(shí)際應(yīng)用相對(duì)較少[28]。研究表明，氯化膽堿作為卵磷脂的重要合成物質(zhì)，對(duì)微生物細(xì)胞膜的合成有著較大的影響，而細(xì)胞膜的合成對(duì)菌體生長(zhǎng)的速度有著限制性的作用，在細(xì)胞膜合成不足的情況下，菌體生長(zhǎng)速率必然受到限制，提供足夠的氯化膽堿有利于菌體細(xì)胞膜的合成，進(jìn)而提高菌體生長(zhǎng)速率[28]；作為多甲基供體，氯化膽堿能夠提供微生物生長(zhǎng)代謝過(guò)程中多種甲基化反應(yīng)所需的活性甲基，當(dāng)菌體生長(zhǎng)過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足或出現(xiàn)轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)上調(diào)時(shí)，甲基群可能成為限制性因素，這些情況會(huì)影響甲硫氨酸在蛋白質(zhì)合成中的有效性，從而降低生長(zhǎng)速度，此時(shí)，氯化膽堿作為甲基供體可以有效緩解這種情況，提高菌體生長(zhǎng)速率[26]；作為一種滲透保護(hù)劑，氯化膽堿能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓，減少菌體生長(zhǎng)過(guò)程中的應(yīng)激反應(yīng)，穩(wěn)定菌體內(nèi)酶的活性以及生物大分子的功能，從而減弱因環(huán)境因素的變化對(duì)菌體活力造成的負(fù)面影響，使得菌體活力能夠維持在一個(gè)較高的水平[29]；作為一種參與細(xì)菌熱保護(hù)作用的物質(zhì)，氯化膽堿能夠保護(hù)檸檬酸合成酶不受熱變性影響，并刺激其復(fù)性，保護(hù)了三羧酸循環(huán)，使菌體在生長(zhǎng)方面表現(xiàn)出更強(qiáng)的穩(wěn)定[30]。

在谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸過(guò)程中適量添加氯化膽堿，有效加快了菌體的生長(zhǎng)速率，但由于發(fā)酵培養(yǎng)基中菌體生長(zhǎng)所需的廣泛類營(yíng)養(yǎng)元素如磷鹽等的總量控制在同一水平，所有批次的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，最終菌體的總量也都維持在同一水平。從實(shí)驗(yàn)中可以看出，L-纈氨酸產(chǎn)量幅增的原因主要有2點(diǎn)：(1)氯化膽堿的添加使得菌體的生物量提前達(dá)到峰值，單位菌體產(chǎn)酸不變的情況下，菌體總量提高，L-纈氨酸單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)酸勢(shì)必增加，這與本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符；(2)氯化膽堿的添加使得菌體內(nèi)各類酶以及生物大分子的活性增強(qiáng)，菌體耗糖速率增加，在后期菌體總量一致的情況下，單位菌體單位時(shí)間轉(zhuǎn)化葡萄糖的速率增大，從而導(dǎo)致L-纈氨酸的產(chǎn)量增加，與本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。氯化膽堿的添加對(duì)于提高菌體生長(zhǎng)速率以及產(chǎn)酸速率方面有著顯著效果，使產(chǎn)酸高峰期提前，壓縮了整個(gè)發(fā)酵周期，與優(yōu)化前發(fā)酵實(shí)驗(yàn)相比較，優(yōu)化后批次發(fā)酵進(jìn)行至40 h產(chǎn)酸即達(dá)到前者進(jìn)行至52 h時(shí)的水平，極大地提高了發(fā)酵的效率。同時(shí)，本研究的結(jié)果為谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸在高密度菌體發(fā)酵方面的研究提供了思路，同時(shí)也為縮短L-纈氨酸發(fā)酵生產(chǎn)周期提供了方案。

3 結(jié)論

氯化膽堿的外源添加能夠有效增強(qiáng)菌體的活力，加快菌體生長(zhǎng)，提高菌體產(chǎn)酸速率。本研究通過(guò)對(duì)氯化膽堿的添加量以及添加方式進(jìn)行探索，確定了谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸過(guò)程中添加氯化膽堿的一種有效方式以及添加量；實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)在谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基底物中添加0.5 g/L的氯化膽堿，同時(shí)在發(fā)酵過(guò)程中隨糖流加1 g/L濃度的氯化膽堿，能夠有效提高菌體活力，加快菌體生長(zhǎng)以及產(chǎn)酸速率，經(jīng)過(guò)52 h的發(fā)酵培養(yǎng)，L-纈氨酸產(chǎn)量最終達(dá)到86.2 g/L，較添加前的產(chǎn)量提升了26.4%，糖酸轉(zhuǎn)化率穩(wěn)定在36%左右。