王遠(yuǎn)山，龔美華，曹成浩，薛亞平

1(生物有機(jī)合成浙江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(浙江工業(yè)大學(xué))，浙江 杭州，310014)2(教育部生物轉(zhuǎn)化與生物凈化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(浙江工業(yè)大學(xué))，浙江 杭州，310014 3(手性生物制造國家地方聯(lián)合工程研究中心(浙江工業(yè)大學(xué))，浙江 杭州，310014)

脫酰基酶(decetylase,EC 3.5.1.X)是一類能夠催化底物脫去酰胺的水解酶，其中脫乙?；甘且活惸艽呋瘞锥≠|(zhì)或蛋白質(zhì)水解脫去乙?；纬蓺ぞ厶腔蛎撘阴；鞍踪|(zhì)的水解酶[1-2]。脫?；笍V泛存在于動(dòng)物、植物以及微生物體內(nèi)，被應(yīng)用于?；幕衔锸中圆鸱郑陨a(chǎn)光學(xué)純的醫(yī)藥、臨床、食品等領(lǐng)域的產(chǎn)品或者中間體，工業(yè)應(yīng)用前景廣闊[3-5]。如殼聚糖脫乙酰基酶可以用于水解甲殼素制備殼聚寡糖[6-8]。來源于鏈霉菌(Streptomycespulverzceus)的棘白霉素B(ECB)脫?；竅9-11]可催化ECB脫酰基獲得棘白霉素B母核。然而，像絕大多數(shù)外源基因一樣，脫乙?；富蛟诖竽c桿菌、酵母菌等表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)時(shí)，易在細(xì)胞內(nèi)凝集，形成不溶的、無活性、高密度、無定形[12]、非水溶性、可溶于變性劑物質(zhì)如尿素、鹽酸胍的包涵體[13]。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)因其無致病性、遺傳背景清晰、分泌蛋白能力強(qiáng)、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、耐高溫等優(yōu)點(diǎn)，成為異源表達(dá)和分泌外源蛋白的理想宿主[14-16]。目前利用枯草芽孢桿菌表達(dá)脫乙酰基酶的研究基本未見報(bào)道，因此，可以嘗試?yán)每莶菅挎邨U菌的組成型分泌表達(dá)系統(tǒng)可溶性表達(dá)脫乙?；?。

本實(shí)驗(yàn)室已篩選到一個(gè)能夠立體選擇性水解乙?；被嵘a(chǎn)L-氨基酸的脫乙?；窷AP-Das 2.3，但在E.coli表達(dá)系統(tǒng)中會(huì)形成大量包涵體。為實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，本文參考相關(guān)文獻(xiàn)[17-20]，將NAP-Das 2.3編碼基因克隆至枯草芽孢桿菌構(gòu)建重組工程菌，優(yōu)化了工程菌的培養(yǎng)及產(chǎn)酶條件，實(shí)現(xiàn)了異源高效可溶性表達(dá)，為脫乙?；傅拈_發(fā)和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

pP43NMK質(zhì)粒，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物工程重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送；E.coliJM109和B.subtilisWB800，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 主要工具酶、試劑和試劑盒

限制性內(nèi)切酶XhoI、BamHI、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、ClonExpress?II一步克隆試劑盒等，Vazyme公司；質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒等，Axygen生物技術(shù)有限公司；DNA Marker、protein Marker、TaqDNA Polymerase、染色劑Gold View等，TaKaRa公司；卡那霉素、氨芐青霉素等，大連寶生物公司；溶菌酶，生工生物工程(上海)有限公司；其他試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備

Biometra PCR儀，Biometra公司；SevenMulti pH計(jì)，瑞士Mettler-Toledo；Sorvall Lynx 4 000高速冷凍離心機(jī)，Thermo Scientific公司；5 L全自動(dòng)發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；Mini-Protean II型電泳儀、GelDoc凝膠成像儀，Bio-Rad公司；30 kDa超濾離心管，Millipore公司；BioLogic LP蛋白純化儀，美國Bio-Rad公司；5417R小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司。MS-100恒溫金屬振蕩反應(yīng)器，杭州奧盛儀器有限公司；NanoDrop One/OneC微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀，美國Thermo公司；ExpressPlusTM聚丙烯酰胺蛋白預(yù)制膠，金斯瑞生物科技有限公司；UltiMate3000高效液相色譜，美國戴安公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 脫乙?；妇幋a基因的獲得及其重組表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

脫乙?；妇幋a基因nap-das2.3由本實(shí)驗(yàn)室以Arenimonasmalthae的amidohydrolase(GenBank登錄號(hào)WP 043803585.1)為模板合成，克隆至載體pET 28b(+)的限制性酶切位點(diǎn)XhoI和BamHI之間，并將重組質(zhì)粒pET 28b/nap-das2.3轉(zhuǎn)入E.coliBL21，獲得重組菌E.coliBL21/pET 28b/nap-das2.3。將E.coliBL21/pET 28b/nap-das2.3及實(shí)驗(yàn)室保藏的E.coliDH5α/pP43NMK用AxyPrep質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒。重組質(zhì)粒pET 28b/nap-das2.3用XhoI、BamHI酶切獲得目的基因片段nap-das2.3。根據(jù)載體pP43NMK上目的基因插入位點(diǎn)兩端的序列及nap-das2.3序列設(shè)計(jì)PCR引物。插入片段擴(kuò)增引物(F1/R1)，上游引物F1：5′-GTAAGAGAGGAATGTACACATGATTAGATGGAGCTTTCAA-3′；下游引物R1：5′-CCTTTCGCCCGTCACTCAAGTGGTTGTTGTTAGAAGAGTA-3′。線性化克隆載體的擴(kuò)增引物(F2/R2)，上游引物F2：5′-CATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGATT-3′；下游引物R2：5′-CCTTTC GCCCGTCACTCAAGTGGTTGTTGTTAGAA-3′。PCR反應(yīng)采用50 μL體系，PCR反應(yīng)條件為：98 ℃、3 min；98 ℃、10 s；65 ℃、15 s；72 ℃、20 s，30個(gè)循環(huán)；71 ℃、10 min，隨后用DpnI消化10 min降解擴(kuò)增模板后置于65 ℃加熱20 min使DpnI失活。線性化克隆載體直接用于連接，目的基因擴(kuò)增片段經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒清洗之后用于連接。回收后的目的基因片段和線性載體的濃度用NanoDrop One/OneC微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀測(cè)定后，用ClonExpress?II一步克隆試劑盒連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliJM109，轉(zhuǎn)化液涂布于含50 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上37 ℃恒溫培養(yǎng)10～12 h，挑取轉(zhuǎn)化子用菌落PCR法鑒定并送杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確的即為陽性轉(zhuǎn)化子pP43NMK/nap-das2.3。

1.2.2 重組工程菌株的構(gòu)建和驗(yàn)證

將重組質(zhì)粒pP43NMK/nap-das2.3通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法[21-22]轉(zhuǎn)化B.subtilisWB800感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化液涂布于含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)20 h左右，挑取轉(zhuǎn)化子，先用溶菌酶將細(xì)胞壁溶解后，再用菌落PCR法擴(kuò)增重組質(zhì)粒序列，PCR擴(kuò)增引物及反應(yīng)條件同上，產(chǎn)物經(jīng)9 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶大小正確的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確的即為陽性重組工程菌株B.subtilisWB800/pP43NMK/nap-das2.3。

1.2.3B.subtilisWB800/pP43NMK/nap-das2.3的培養(yǎng)和NAP-Das2.3表達(dá)

挑取LB平板上的陽性轉(zhuǎn)化子，分別接種于裝有5 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，4 ℃、9 000 r/min離心10 min，收集上清液。在50 mL具塞三角反應(yīng)瓶中加入100 mmol/LN-乙酰-草銨膦的磷酸鈉緩沖溶液(100 mmol/L，pH 8.0)1 mL，4 mL磷酸鈉緩沖溶液(100 mmol/L,pH 8.0)，于35 ℃、180 r/min水浴搖床培養(yǎng)0.2 mL發(fā)酵上清液，每隔5 min，取1 mL至已加入10 μL 6 mol/L HCl的1.5 mL EP管中終止反應(yīng),再加6 mol/L NaOH調(diào)回反應(yīng)液pH，在12 000 r/min、4 ℃的條件下離心10 min，取上清反應(yīng)液，過0.22 μm濾膜，以未加入酶液的平行樣為空白對(duì)照組。200 μL反應(yīng)液與400 μL衍生化試劑在35 ℃反應(yīng)5 min，再加入400 μL超純水至終體積為1 mL，經(jīng)過0.22 μm孔徑的濾膜過濾后進(jìn)行HPLC分析。35 ℃下每分鐘催化生成1 μmolL-草銨膦所需要的酶量定義為1個(gè)活力單位(U)。發(fā)酵上清液加入等體積2×還原型SDS，沸水浴10 min后，用SDS-PAGE凝膠電泳分析蛋白表達(dá)情況。

生物量(細(xì)胞干重，DCW)測(cè)定：將發(fā)酵液離心去上清后，經(jīng)磷酸鈉緩沖溶液(100 mmol/L,pH 8.0)洗滌2次后收集菌體，置于烘箱中，80 ℃烘至恒重。

1.2.4 搖瓶培養(yǎng)條件的優(yōu)化

保持種子活化培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件不變(LB培養(yǎng)基、37 ℃、150 r/min培養(yǎng)10～12 h)，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及產(chǎn)酶條件進(jìn)行考察，進(jìn)行單因子搖瓶?jī)?yōu)化實(shí)驗(yàn)，主要包括：不同碳氮源種類及濃度、磷酸鹽、金屬離子、初始培養(yǎng)基pH、培養(yǎng)溫度對(duì)重組脫乙?；傅漠a(chǎn)酶情況及菌體生長的影響。

1.2.5 5 L發(fā)酵罐中菌體生長及產(chǎn)酶情況

搖瓶發(fā)酵最優(yōu)條件確定后，在5 L發(fā)酵罐進(jìn)行擴(kuò)大，種子液接種量2%(V/V)，優(yōu)化后的液體培養(yǎng)基3 L，培養(yǎng)溫度37 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min，通氣量0.5 VVM，自然pH，連接pH電極及溶氧(DO)電極，每隔2.5 h取樣測(cè)定發(fā)酵液pH、菌體濃度和酶活力等參數(shù)。

1.3 分析方法

L-草銨膦的檢測(cè)：SinoPak-C18(4.6 mm×200 mm，5 μm，伊力特)色譜柱；高效液相色譜儀Dionex UltiMate 3 000；V(甲醇)∶V(0.05 mol/L乙酸銨溶液)=10∶90(pH 5.7)，流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長350 nm，發(fā)射波長450 nm；柱溫35 ℃，進(jìn)樣體積10 μL。

衍生化試劑的配制：分別準(zhǔn)確稱取0.1 g鄰苯二甲醛和0.12 gN-乙?；?L-半胱氨酸，用10 mL無水乙醇充分溶解，隨后用硼酸緩沖液(pH 9.8)定容至終體積50 mL，置于冰箱中4 ℃避光保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫乙?；富虻墨@得及其重組表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

2.1.1 線性化擴(kuò)增載體及目的基因片段的克隆

經(jīng)分別帶有載體末端序列的引物F1/R1及帶有目的基因末端序列的引物F2/R2擴(kuò)增后，得到8 000 bp線性化載體和1 299 bp目的片段。

2.1.2 重組質(zhì)粒pP43NMK/nap-das2.3構(gòu)建和鑒定

目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Clean up清洗試劑盒純化后與線性化載體擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)量濃度后，計(jì)算用量，在一步克隆試劑盒反應(yīng)體系中，相互連接，并轉(zhuǎn)化E.coliJM109，技術(shù)路線見圖2。菌落PCR呈陽性的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒送至杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。連接產(chǎn)物序列正確的菌株提取質(zhì)粒待用。

圖2 重組質(zhì)粒pP43NMK/nap-das2.3的構(gòu)建過程Fig.2 Construction of the recombinant plasmid pP43NMK/nap-das2.3

2.2 重組菌株的構(gòu)建和菌落PCR鑒定

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到B.subtilisWB800感受態(tài)中，轉(zhuǎn)化液涂布于50 μg/mL卡那霉素LB平板，隨機(jī)挑取單菌落提取質(zhì)粒，以F2/R2為引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證。菌落PCR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在8 000～12 000 bp之間有明亮的特異性條帶，與預(yù)期的陽性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒大小吻合。

2.3 重組菌株的SDS-PAGE分析

挑取4個(gè)陽性轉(zhuǎn)化子接種于含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)30 h，培養(yǎng)液經(jīng)9 000 r/min，4 ℃離心10 min，離心收集上清液。將全細(xì)胞培養(yǎng)液及離心上清液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)情況，結(jié)果見圖3。根據(jù)氨基酸序列推算出NAP-Das2.3理論分子量是48.5 kDa。全細(xì)胞培養(yǎng)液和離心上清液，均出現(xiàn)了分子量約50 kDa的蛋白質(zhì)條帶，與預(yù)期的目的蛋白質(zhì)大小相符，證明重組NAP-Das2.3的枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建成功，NAP-Das2.3成功表達(dá)。

M1,M2-marker；1,2-B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3發(fā)酵液；3,4-發(fā)酵上清液圖3 重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE of the culture broth and supernatant of B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3

2.4 重組菌的酶活力的測(cè)定

經(jīng)檢測(cè)，重組菌B.subtilisWB800/pP43NMK/nap-das2.3能夠可溶性表達(dá)NAP-Das2.3，但活力較低，發(fā)酵上清液中脫乙?；富盍?.25 U/L。由于NAP-Das2.3搖瓶發(fā)酵表達(dá)量及酶活較低，進(jìn)一步對(duì)菌體培養(yǎng)及產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化以提高表達(dá)量。

2.5 重組菌搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.5.1 碳源對(duì)菌體生長及產(chǎn)酶的影響

考察了不同有機(jī)碳源(葡萄糖、糊精、甘油、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖、山梨醇、甘露醇、乳糖、D-果糖)和最優(yōu)碳源質(zhì)量濃度對(duì)重組菌B.subtilisWB800/pP43NMK/nap-das2.3菌體生長及產(chǎn)酶的影響。由圖4-a可知，甘油和乳糖促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)酶，發(fā)酵液中NAP-Das2.3的相對(duì)酶活分別為18.68和18.45 U/L，與對(duì)照組(不添加碳源，比酶活為15.21 U/L)相比，酶活分別提高了22.81%和21.32%，因此選擇甘油作為最優(yōu)碳源。這與CHOU等[23]報(bào)道的添加甘油有利于降低包涵體并提高E.coli周質(zhì)青霉素G酰化酶表達(dá)量一致。

雖然D-果糖、葡萄糖、糊精對(duì)菌體生長的促進(jìn)作用較大，但添加可溶性淀粉、D-果糖、山梨醇、麥芽糖、糊精和蔗糖不利于NAP-Das2.3的表達(dá)。由圖4-b可知，當(dāng)甘油質(zhì)量濃度為6 g/L時(shí)，發(fā)酵液中的NAP-Das2.3酶活達(dá)最高，為28.53 U/L，繼續(xù)增加甘油，生物量有所增大，但對(duì)NAP-Das2.3表達(dá)有抑制作用。故選擇甘油的濃度為6 g/L作為菌株后續(xù)優(yōu)化培養(yǎng)的碳源濃度。

圖4 碳源對(duì)B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3生長和產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of carbon sources on growth and NAP-Das2.3 expression of B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3

2.5.2 氮源對(duì)菌體生長及產(chǎn)酶的影響

考察了14種有機(jī)氮源及其組合(豆粕、酵母膏、玉米粉、牛肉膏、花生粉、黃豆餅粉、蛋白胨、酵母浸出汁、酵母提取物、麩皮、麥芽浸汁、牛肉膏和蛋白胨、牛肉膏和酵母粉、蛋白胨和酵母粉)和無機(jī)氮源((NH4)2SO4、NH4H2PO4、NH4Cl、CH3COONH4、HCOONH4、NaNO2、NaNO3、尿素)以及最適氮源質(zhì)量濃度對(duì)重組菌生長和產(chǎn)酶的影響。由圖5-a可知，10 g/L牛肉膏、麥芽浸汁、黃豆餅粉、玉米粉添加后，NAP-Das2.3活力均有顯著提高。而且添加10 g/L牛肉膏和麥芽浸膏后，發(fā)酵液中分泌的粗酶液酶活與對(duì)照組相比分別提高了123.23%和115.07%。但組合氮源對(duì)重組菌產(chǎn)酶影響不顯著，花生粉、豆粕、麩皮的加入反而抑制產(chǎn)酶。

圖5 氮源對(duì)B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3菌體生長和產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of nitrogen sources on growth and NAP-Das2.3 expression of B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3

相比有機(jī)氮源，所測(cè)試的所有無機(jī)氮源都不利于菌體生長，對(duì)外源蛋白表達(dá)沒有顯著促進(jìn)作用，并且添加(NH4)2SO4、NH4Cl、CH3COONH4、NaNO2、HCOONH4、尿素等無機(jī)氮源不利于NAP-Das2.3的表達(dá)，結(jié)果如圖5-b。當(dāng)牛肉膏以30 g/L(質(zhì)量濃度)添加時(shí)，菌體生長及蛋白表達(dá)量均達(dá)最高值，為2.75 DCW g/L和63.22 U/L，結(jié)果如圖5-c所示。

2.5.3 磷酸鹽對(duì)菌體生長和產(chǎn)酶的影響

在上述優(yōu)化后的碳源和氮源的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察了NH4H2PO4、NaH2PO4、Na2HPO4、KH2PO4、K2HPO4五種磷酸鹽對(duì)菌體生長和產(chǎn)酶的影響，磷酸鹽的總添加量為10.0 g/L。由圖6所示，測(cè)試的磷酸鹽對(duì)產(chǎn)酶沒有顯著促進(jìn)作用，而且NaH2PO4對(duì)重組菌產(chǎn)酶還有抑制，所以培養(yǎng)基中不需要額外添加磷酸鹽。

圖6 不同磷酸鹽對(duì)B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3生長和產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of phosphorus sources on growth and NAP- Das2.3 expression of B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3

2.5.4 金屬離子對(duì)菌體生長和產(chǎn)酶的影響

考察了13種金屬離子(Co2+、Mg2+、Fe2+、Ni2+、Ba2+、Li+、Zn2+、Mn2+、Sn2+、Ca2+、Fe3+、Cu2+、Cu+)的氯化鹽(2 mmol/L)和表面活性劑EDTA對(duì)菌體生長和產(chǎn)酶的影響。如表1所示，金屬離子Fe2+、Li+、Ca2+、Cu+、Cu2+等加入均抑制菌體生長，對(duì)菌體有顯著毒害，其中EDTA對(duì)菌體抑制相對(duì)較小，但所有金屬離子對(duì)產(chǎn)酶沒有顯著影響(86.88%～107.10%)，所以培養(yǎng)基中不需要添加金屬離子及EDTA。

2.5.5 初始培養(yǎng)基pH對(duì)菌體生長和產(chǎn)酶的影響

如圖7所示，研究了發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH(pH 5.0～9.5)對(duì)B.subtilisWB800/pP43NMK/nap-das2.3的生長及產(chǎn)酶的影響。初始pH對(duì)菌體生長沒有顯著影響，但對(duì)菌株產(chǎn)酶影響較為明顯。當(dāng)pH<6.5時(shí)，重組酶活力較低，初始pH在6.5～8.0，NAP-Das2.3活力較高，在pH 7.5時(shí)菌株的酶活力達(dá)到最高，為68.21 U/L。pH繼續(xù)增大時(shí)，酶活力下降趨勢(shì)明顯，因此選擇pH 7.5作為培養(yǎng)該菌株時(shí)的培養(yǎng)基初始pH。

表1 不同金屬離子及EDTA對(duì)B.subtilis WB800/ pP43NMK/nap-das2.3生長及產(chǎn)酶的影響Table 1 Effect of different metal ions and EDTA on growth and NAP-Das2.3 expression of B.subtilis WB800/ pP43NMK/nap-das2.3

圖7 初始pH對(duì)B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3生長和產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of initial pH on growth and NAP-Das2.3 expression of B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3

2.5.6 培養(yǎng)溫度對(duì)菌體生長及產(chǎn)酶的影響

在最適碳氮源及其最適濃度，以及最適培養(yǎng)初始pH條件下，進(jìn)一步研究了培養(yǎng)溫度對(duì)菌體生長和NAP-Das2.3酶活力的影響。選擇20、25、28、30、35、37、40、45 ℃進(jìn)行考察，結(jié)果如圖8所示，溫度低于25 ℃時(shí)，不利于菌株的生長和NAP-Das2.3的表達(dá)，溫度在28～37 ℃范圍內(nèi)，菌體生長良好且酶活力隨著溫度的升高而大幅度增大，菌株在37 ℃條件下生長狀態(tài)最佳，且此時(shí)酶活力最高，發(fā)酵液中酶活力達(dá)106.42 U/L。溫度進(jìn)一步升高，酶活及菌體濃度降低，因此選擇培養(yǎng)溫度為37 ℃進(jìn)行菌體培養(yǎng)及發(fā)酵產(chǎn)酶。

圖8 培養(yǎng)溫度對(duì)B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3生長和產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of temperature on growth and NAP-Das2.3 expression of B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3

2.6 5 L發(fā)酵罐中重組菌的生長及產(chǎn)酶情況

將保藏的B.subtilisWB800/pP43NMK/nap-das2.3活化后接種500 mL搖瓶，37 ℃培養(yǎng)12 h作為發(fā)酵種子液，以2%接種量轉(zhuǎn)接至3 L優(yōu)化后的液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，37 ℃，200 r/min，通氣量為0.5 VVM，自然pH，用pH電極及溶氧(DO)電極檢測(cè)發(fā)酵液的pH和溶氧，定時(shí)取樣測(cè)定發(fā)酵液的pH、菌體濃度并測(cè)定酶活力等參數(shù),結(jié)果如圖9所示。

圖9 5 L發(fā)酵罐中B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3的生長和產(chǎn)酶曲線Fig.9 Time course of cell growth and NAP-Das2.3 expression of B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3 in 5 L bioreactor

在菌體培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)體系pH隨培養(yǎng)時(shí)間的增加先略微下降再逐漸升高，這可能因?yàn)樵谇捌诰w生長過快，導(dǎo)致溶氧不足發(fā)生厭氧呼吸產(chǎn)生酸導(dǎo)致pH下降，后期隨著氮源的利用，釋放出氨及菌體自溶導(dǎo)致pH上升。發(fā)酵菌體生長在22.5 h后開始穩(wěn)定產(chǎn)酶，此時(shí)菌體生長處在穩(wěn)定中后期，說明NAP-Das2.3主要是在穩(wěn)定中后期完成加工成熟。培養(yǎng)至25 h時(shí)，酶活力達(dá)到最大116.13 U/L并穩(wěn)定不變，而生物量在培養(yǎng)至27.5 h時(shí)達(dá)最大5.63 g/L，之后菌株進(jìn)入衰亡期開始裂解，生物量和比酶活開始下降。

目前，利用基因工程手段對(duì)脫?；高M(jìn)行異源重組表達(dá)的報(bào)道較多。如舒群峰等[24]將黏質(zhì)沙雷氏菌SerratiamarcescensY213來源的SmargE基因編碼的N-乙酰鳥氨酸脫乙?；冈贚-鳥氨酸生產(chǎn)菌株CorynebacteriumcrenatumSYPO-1中過量表達(dá)，顯著提高了酶活力，重組菌在5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵96 h，L-鳥氨酸產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高了33.2%，但該酶是在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，對(duì)脫乙?；复呋拿撘阴；磻?yīng)而言，胞外可溶性表達(dá)可以減少酶的分離純化步驟，有利于酶的固定化等，使用酶蛋白進(jìn)行催化也可以減少副產(chǎn)物的形成。WANG等[25]將來自Aspergillusnidulans的幾丁質(zhì)脫乙酰基酶基因異源表達(dá)于EscherichiacoliBL21，經(jīng)誘導(dǎo)后的酶活為4.17 U/mg，但是該酶以包涵體形式表達(dá)。而本研究利用枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了脫乙?；窷AP-Das2.3的分泌型可溶性表達(dá)，這與KANG等[26]將來自Colletotrichumlindemuthianum的幾丁質(zhì)脫乙酰基酶基在畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115中異源分泌表達(dá)一樣，有助于脫乙?；傅募兓⒐潭ɑ皯?yīng)用。

3 結(jié)論

本文將具有立體選擇性的脫乙酰基酶基因克隆至枯草芽孢桿菌受體細(xì)胞中，構(gòu)建了重組菌B.subtilisWB800/pP43NMK/nap-das2.3，并成功實(shí)現(xiàn)胞外分泌。進(jìn)一步對(duì)重組菌培養(yǎng)及發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，在此條件下，重組蛋白的表達(dá)水平由最初的0.25 U/L提高至106.42 U/L，優(yōu)化后酶活提高了424.68倍。在5 L發(fā)酵罐中用優(yōu)化的培養(yǎng)基培養(yǎng)30 h后，NAP-Das2.3活力達(dá)到116.13 U/L，較初始條件，酶活提高了463.52倍。

本研究構(gòu)建了能夠可溶性表達(dá)草銨膦特異性脫乙酰基酶的基因工程菌B.subtilisWB800/pP43NMK/nap-das2.3，一定程度上解決了脫乙酰基酶高效異源表達(dá)形成包涵體及表達(dá)量低的問題，且能直接組成型分泌表達(dá)脫乙?；赣诎l(fā)酵液中，為重組酶的分離純化帶來便利。綜上所述，本研究實(shí)現(xiàn)了重組脫乙?；傅母咝Э扇苄员磉_(dá)，為其在L-草銨膦合成應(yīng)用中提供了基礎(chǔ)，也為其他脫乙?；傅拈_發(fā)提供了借鑒。