蘇 慧 許 浩張利闖 徐雙夢 魏 延*,,2杜晶晶,2 黃 棣,2

(1太原理工大學生物醫(yī)學工程學院生物醫(yī)學工程系,納米生物材料與再生醫(yī)學研究中心,太原 030024)

(2太原理工大學生物醫(yī)學工程研究所,材料強度與結構沖擊山西省重點實驗室,太原 030024)

生物礦化是生物體形成無機功能礦物的過程,它普遍存在于自然界[1].目前已知很多生物體都可以在有機基質調控下形成各種各樣的礦化結構來滿足自身需求,例如一些海洋生物利用生物礦物保護自身不受外界傷害[2],一些植物(硅藻)也可以通過形成二氧化硅細胞壁對自身進行保護等[3].但自然界中大多數細胞并不具有保護功能的殼層,且細胞的穩(wěn)定性和功能性易受環(huán)境影響,因此科學家們提出"仿生礦化"的概念,即用各種材料人為包裹活細胞來實現對細胞的保護并賦予細胞新的功能,Tang等[4]率先在國際上提出"細胞殼化"的概念,為實現細胞功能化提供了一條新思路和行之有效的策略.細胞表面殼化,尤其是單細胞水平的殼化,可以結合高精度的顯微成像技術和高靈敏的傳感技術,從形態(tài)、亞細胞結構、蛋白含量、細胞代謝產物等方面對單細胞進行分析,揭開細胞功能化及其應用的新領域.我們認為,通過為活細胞人工制造殼結構來改進細胞固有的性質或賦予細胞新的功能對人類來說是一個重大的機遇.基于研究重點,本文主要是從單細胞水平綜合介紹了目前可進行殼化的細胞種類、殼化的方法以及細胞殼化在環(huán)境與生物醫(yī)學領域的應用,并對該領域的研究前景進行了展望.

1 可殼化的細胞類型

雖然細胞表面功能化的發(fā)展史只有短短幾十年,但是研究者們已在多種細胞表面實現了功能化(圖1).酵母菌因其典型的結構與特性,作為生物模型,較先實現了細胞殼化[5].Diaspro等[6]用聚電解質PAH/PSS包裹單個酵母菌,并研究了酵母菌的代謝功能及其生長特性等.之后在保證酵母細胞存活的情況下,進行熒光標記并導入到草履蟲的體內,結果顯示在草履蟲體內包被的酵母菌雖然未受保護,但用聚電解質在酵母菌表面進行殼化的方法是可取的.Tsukruk等[7]使用了一種pH敏感性的包被層包埋酵母細胞,從而能夠通過調節(jié)pH值的變化來控制酵母菌的生長.唐?？嫡n題組[8]研究發(fā)現,受多糖細胞壁結構的影響,電荷密度較低導致酵母細胞表面難以直接形成鈣礦物層,而通過層層自組裝的方法引入功能聚合物聚丙烯酸(PAA)后,可顯著提高細胞礦化能力.因PAA具有高密度的羧酸基團,為鈣礦物提供了活性成核位點.當吸附的PAA分子位于酵母細胞的最外層時,羧酸基團向水-聚合物界面遷移并結合Ca2+離子.在與鈣化溶液接觸后,重組的表面誘導鈣礦物質的異質成核,細胞的礦化能力大大提高.

在酵母細胞上取得成功后,研究者們又轉向原核生物領域,在細菌、孢子、藍藻、益生菌[9-10]等原核細胞上也實現了聚電解質膜和無機礦物殼的包裹.例如,Mirkin等[11]用單層納米金顆粒(gold nanoparticles,AuNPs)包被黑曲霉菌、特異青霉菌、毛霉菌和鏈霉菌的活細胞體;Johnson等[12]報道了一種噴霧干燥的方法,將K12大腸桿菌完全封裝在脂質二氧化硅納米復合材料中,發(fā)展了一種新的生物殼化技術;利用基因工程技術在具有非細胞結構的M13噬菌體表面合成混合金鈷氧化物外殼也獲得了成功[13].

圖1 細胞表面功能化的發(fā)展過程及所應用的細胞種類[11,15,27-36]Fig.1 Development of cell surface functionalization and the types of cells applied[11,15,27-36]

對于高等真核生物細胞,人們同樣嘗試利用生物殼工程的技術對其進行表面修飾.早期研究者們在多種類型的動物細胞上實現了包裹,包括人血紅細胞、血小板、胰島細胞、胚胎干細胞、T淋巴細胞等[14-21].匡潔等[22]用海藻酸鈉/殼聚糖/海藻酸鈉(ACA)微囊包裹肝細胞,并對包裹后肝細胞的功能以及活性進行探索,發(fā)現被包埋的肝細胞可在較短的時間實現細胞擴增,外周的微殼對肝細胞的活性無影響,但可阻擋大分子免疫球蛋白,兩者結合有利于維持肝細胞白蛋白分泌功能及細胞活性.近年來,人們對間充質干細胞的研究成為新的熱點.此前,對間充質干細胞的封裝主要是通過制備膠原微球來實現[23],而Etter等[24]利用微流體設備(MFDS)在人間充質干細胞外制備了均相并且力學性能可調的海藻酸鹽微球.基于以上多種生物細胞表面修飾取得的成功,研究者們思考,能否采用同樣的方法,對難以控制的癌細胞進行某些功能設計?宋旸等[25]用親水性的瓊脂糖包裹大鼠的乳腺癌細胞(SHZ-88),使其在凝膠內部生長,并收集其上清液作用于人類乳腺癌細胞(MCF-7),發(fā)現可以有效抑制人MCF-7細胞的生長.本課題組的Wei等[26]通過聚電解質誘導,成功在癌細胞表面形成人工的礦物質外殼,研究發(fā)現這種外殼可能會有效地限制癌細胞的遷移和侵襲能力.

2 細胞表面殼化的方法

2.1 層層自組裝法

層層自組裝(LBL)技術,是上世紀90年代發(fā)展起來的一種簡易、多功能的表面修飾方法,它借助不同層分子之間的相互作用(如靜電力,氫鍵,配位鍵等)逐層交替沉積在帶電模板上,使層與層之間形成穩(wěn)定的具有某種特定功能的分子聚集體或超分子結構.這種技術被認為是制備復合薄膜的一種有效手段,已經被廣泛應用于細胞表面包裹納米材料領域[28,37-38](圖 2).

許碧超[39]利用帶相反電荷的PDDA/PSS在大腸桿菌細胞表面交替沉積形成膜結構,靜電作用亦可有效吸附二氧化硅納米粒子在其表面成殼,實現了單細胞的包埋,雖然聚電解質復合膜能夠影響大腸桿菌的形貌,但二氧化硅外殼能夠提高細胞抵抗?jié)B透壓的能力,且包裹復合膜的大腸桿菌仍然保持了良好的生長、分裂能力.李文龑[40]用層層自組裝的方法以明膠/藻朊酸為聚電解質包裹神經干細胞,并證實包被的神經干細胞其存活增殖以及分化不會受到明顯的干預,而后利用同樣的技術將修飾胰島素生長因子-1(IGF-1)的藻朊酸跟明膠包裹在細胞表面,IGF-1被持續(xù)釋放并呈現pH依賴性.雄鷹等[41]用改性的殼聚糖代替聚賴氨酸為聚電解質,制備了由海藻酸鈉/殼聚糖包被的SK-OV-3細胞,將其移植到小鼠的腹腔內,結果表明SK-OV-3細胞在小鼠的腹腔內保持良好生長狀態(tài).Carter等[42-43]結合氫鍵LBL法,利用鞣酸(TA)與聚吡咯烷酮(PVPON)包埋活性酵母細胞,且包埋后的酵母細胞活性較高.Yang等[44]運用聚多巴胺與酵母細胞表面蛋白的胺基或巰基的共價鍵作用在酵母細胞表面包覆成膜,有效地提高了酵母細胞抵抗溶壁酶的能力.

圖2 在層層自組裝過程中高分子在基底表面吸附過程Fig.2 Polymer adsorption process on the substrate surface during layer upon layer self-assembly

2.2 水凝膠法

生物醫(yī)用水凝膠是一種含有大量親水基團而呈現較大的吸水、溶脹特性的三維網狀高分子材料,具備良好的生物相容性和生物可降解性;此外,其質地柔軟,可模擬機體為細胞粘附、生長等過程提供相似的營養(yǎng)及氣體環(huán)境.細胞表面水凝膠殼化結構不僅可以降低細胞治療過程中的免疫排斥反應,而且可以提高細胞的結構穩(wěn)定性.常被用作細胞表面水凝膠殼化的材料有瓊脂、膠原、海藻酸鹽、多聚賴氨酸等[23,45-48].

目前,以水凝膠作為細胞外殼化材料修飾干細胞的方法已經得到了較為廣泛的應用.商青青等[49]用透明質酸水凝膠包裹骨髓間充質干細胞,通過體外、體內等實驗表明透明質酸水凝膠能夠提高移植細胞的存活率,且比較移植后4周大鼠的射血分數發(fā)現,透明質酸水凝膠修飾的骨髓間充質干細胞移植到載體后,能夠有效地促進大鼠心肌梗死后心功能的改善.李會敏[50]以3-丙烯酰胺基苯硼酸(AAPBA)和N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)為原料,馬來?；暇厶?Dex-Ma)為交聯劑制備了兼具溫度敏感性和葡萄糖敏感性的水凝膠材料,并用它來包裹胰島瘤細胞.研究發(fā)現,水凝膠-胰島瘤細胞復合體系具備糖濃度調控胰島素分泌模式,為水凝膠體系實現細胞生存環(huán)境的仿真提供了可能.

2.3 溶膠-凝膠法

溶膠-凝膠法,是將化合物通過水解、縮聚等反應形成穩(wěn)定的溶膠體系,經陳化形成凝膠,最后通過干燥、燒結等手段制備出具有納米亞結構材料的方法.因其反應條件溫和,且可以在短時間內實現分子水平的均勻混合,使得其在材料學、催化劑、色譜分析等領域得到了較為廣泛的發(fā)展.雖然傳統(tǒng)溶膠-凝膠法的反應條件已經很溫和,但是對于具有活性的生物來說,其反應過程具有一定的刺激性.

丁霖等[51]運用溶膠-凝膠法制備了金納米粒子-殼聚糖(GNP-CHIT)復合材料,該復合凝膠不僅可以有效地固定K562白血細胞,而且可以在保持細胞活性的基礎上,提升細胞與電極之間的電子傳遞效率.Helen等[52]通過溶膠-凝膠法在細胞與二氧化硅載體材料之間引入了脂質界面,有效地緩解了細胞在SiO2干燥過程中所受到的作用力,從而降低了細胞的失活率.隨后,Dickson等[53]和Meunier[54]等利用二氧化硅凝膠良好的光透過性、其介孔結構可傳輸物質等特性,將它應用于藍藻、擬南芥細胞等光合作用的研究中,發(fā)現形成的二氧化硅凝膠外殼可有效地提高光合作用的效率.

2.4 基因修飾法

基因修飾,就是指利用分子生物學基因工程方法對宿主細胞的DNA序列進行特異性修飾,然后將目的基因導入宿主細胞,從而使宿主細胞的基因型發(fā)生改變,并實現特定的可遺傳功能化改造.在自然界中,許多天然生物礦物都是由于生物體自身的生物礦化作用產生.例如,雞蛋殼的形成是由于雞蛋殼膜所表達的角蛋白硫酸鹽誘導碳酸鈣沉積成核,使方解石在其表面生長成殼[55].這一現象啟示我們可以通過在細胞的可表達基因序列中引入特殊目的基因來促使細胞進行相關表達以賦予細胞新的功能.

Takahashi等[56]借助逆轉錄酶病毒,將基因注入到人體皮膚細胞,成功將分化的人體皮膚纖維細胞改造成與胚胎干細胞類似的"萬能細胞",這種技術能夠用于多種疾病的治療,在生物醫(yī)學領域產生廣泛影響.Müller等[57]將硅礦化基因(Silicatein-α)修飾到大腸桿菌的基因序列中,經過異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導后的大腸桿菌表達了硅酸鹽蛋白,從而實現了活性大腸桿菌能夠在硅酸溶液中自發(fā)性硅礦化的功能(圖3).鄭寶玉[58]以人瘦素(human leptin)基因修飾骨質疏松大鼠骨髓基質細胞與β-磷酸三鈣(β-TCP)結合構建了組織工程化復合物,該復合物不僅具有體內異位成骨的能力,而且可促進患有骨質疏松癥大鼠牙周組織缺損處的再生,為牙周組織工程的研究與治療提供了支持.基因修飾法因其可遺傳性得到了較為廣泛的關注,但基因組容量巨大,基因表達的不穩(wěn)定性也對該方法的應用產生一定的限制.

圖3 大腸桿菌與聚硅酸鹽的封裝方案[57]Fig.3 Scheme of encapsulation of E.coli with poly(silicate)[57]

3 細胞表面殼化的材料類型

自從在生物細胞表面進行殼化修飾實現細胞功能化以來,不同種類的材料被用于細胞表面殼化賦予細胞新的功能.細胞表面功能化所包裹的材料主要分為聚合物、無機材料、金屬納米粒子以及生物活性分子等[59].

3.1 聚合物

聚合物因其具有豐富的基團被用于構建細胞表面殼層,早期主要是以細胞為模板而獲得多種形狀的聚合物膠囊(capsules)進而用在藥物緩釋、組織工程等領域.其中最常用的聚合物是聚電解質.由于自然界存在的細胞種類各異而形狀各異,該技術基于細胞表面的靜電性質,需要在帶有微弱電荷的細胞表面上進行聚電解質多層自組裝 (因為細胞表面電荷在幾納米厚度的層中分布不均勻,第一層吸附的聚電解質不能完全補償細胞表面這種空間分布的表面電荷),最終在細胞表面形成了聚電解質殼,隨后細胞溶解,得到大小和形狀可控的聚電解質微膠囊,這在本質上復制了原始細胞的形態(tài).一般來說,聚電解質微膠囊殼層特性會由模板細胞類型、消化過程、聚電解質種類的性質、溶液性質等因素決定.包裹了聚電解質的細胞表面電荷可以反轉 (正變負、負變正)、細胞表面可以根據應用要求變得或疏松或致密、細胞表面的滲透性也可調控(0.1~15 nm的孔徑)[60-61].聚電解質因所帶電荷不同可以分為聚陽離子和聚陰離子兩種,其中常用的聚陽離子化合物有:聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA),聚丙烯胺鹽酸鹽(PAH),聚乙烯亞胺(PEI),聚多巴胺(PDA),聚賴氨酸(ε-PL)以及殼聚糖(CHI)等;而聚陰離子化合物有:聚苯乙烯磺酸鈉(PSS),聚丙烯酸(PAA),聚谷氨酸(Glu)以及明膠(GE)等.

聚合物材料不僅成功用于細胞表面殼層的構筑,還能夠作為催化模板,誘導無機納米材料在細胞表面形成無機殼層.以往的研究發(fā)現,電子相互作用是生物礦化的關鍵因素[62-63].一般認為,在生物定向礦化作用中最活躍的蛋白質含有富含羧基或其他帶電官能團的區(qū)域[64-65].通過在細胞表面構建帶有羧基的聚電解質殼層,將會促進細胞表面生物仿生礦化的發(fā)生,這也是獲得良好無機殼層的前提.后來的研究中發(fā)現,聚電解質包裹細胞之后會改變細胞某些功能,具體的機理目前揭示較少,推測是因為聚電解質影響細胞表面關鍵蛋白的分泌,進而影響信號分子順利表達.Diaspro等[5]用層層自組裝技術,將PAH/PSS成功封裝在酵母細胞表面;Yang等[44]成功地在酵母細胞表面包裹了功能性的多巴胺殼,研究表明,多巴胺包裹的酵母細胞具有良好的生物活性,但相較于未修飾的細胞,細胞分裂的滯后期隨著包裹層數的增加而增加;Tabrizin等[28]用天然聚電解質(殼聚糖、海藻酸、透明質酸、寡核苷酸)在大腸桿菌細胞表面進行了殼化;Wu等[66]報道了一種通過明膠和聚乙二醇交聯實現對單個Hela細胞納米封裝的溫和方法.這些實驗均顯示出用聚電解質包裹的細胞仍具有良好的生物活性.

3.2 無機材料

自然界的生物在億萬年進化過程中,都有一套完整的保護程序,細胞表面具有細胞膜,一些細胞還有較厚的、力學性能更好的保護殼,例如雞蛋、硅藻、貝類等.但是一些生物細胞并不具備以上的特征,因表面缺乏可以成殼的基團而無法自身殼化.面對日益嚴峻的氣候變化以及生物醫(yī)學研究的要求,研究者從自然界得到啟發(fā),結合聚合物殼的易操作性,基于生物仿生礦化技術,可先在細胞表面構建聚合物殼層為無機礦物提供成核位點,進而實現無機礦物殼層的包覆[67],保護細胞免受極端環(huán)境的刺激,甚至還在細胞貯存、疫苗保存以及異體輸血等領域都有較多的應用.目前,應用于細胞表面功能化的無機材料主要有碳酸鈣[8,68]、磷酸鈣[69-71]、二氧化硅[72-74]、氧化鋅、碳納米管、石墨烯以及四氧化三鐵等.這些無機材料因其所具有的特殊理化性質備受關注,例如碳酸鈣和磷酸鈣是人體主要的鈣源,是一些組織器官的組成部分,具有良好的生物相容性,本課題組研究人員制備了多種晶型納米羥基磷灰石,并研究了其在人體骨修復等領域的應用[75-81];氧化鋅具有一定的抗菌性;碳納米管跟石墨烯具有良好的導電性;四氧化三鐵具有較強的磁性等等.由于所選模板細胞不同、所需功能不同,故而沉積的無機材料也不同,研究表明,調控鈣礦化的通常 都含有羧基(-COOH)[63,82-85],而調控硅礦化的通常帶有(-NH2)或-NH-[68,86-92].

圖4 (a)酵母細胞去除后的碳酸鈣中空微膠囊的電鏡圖[93];(b)將酵母細胞固定在玻碳電極上的示意圖[68];(c)NP在WSG-Fe3O4-SK-OV-3上分布的透鏡圖[95]Fig.4 (a)Electron microscopy of calcium carbonate hollow microcapsules removed from yeast cells[93];(b)Schematic representation of the immobilization of yeast cells onto glassy carbon electrodes[68];(c)Lens diagram of NP distribution on WSG-Fe3O4-SK-OV-3[95]

Fakhrullin等[93]還直接將碳酸鈣沉積在酵母細胞的細胞壁上,將單個活酵母細胞封裝在CaCO3微殼中,制備了細胞-無機核-殼的混合微粒子(圖4a),證明了用碳酸鈣包覆細胞的可行性.另外Fakhrullin等[68]還用聚電解質逐層組裝的方法將碳納米管包裹在聚電解質PAA/PSS包裹的釀酒酵母細胞的表面,然后又包裹了雙層聚電解質(圖4b),研究證明,包裹的細胞有良好的生物活性,最后,采用伏安法和電化學阻抗法進行了電化學研究,表明復合聚電解質/多壁碳納米管涂層的酵母細胞與人工電子受體之間有足夠的電子介導作用,從而有可能區(qū)分細胞的死活.Xiong等[94]在藍藻上誘導形成人工仿生硅化外殼,發(fā)現并證明被二氧化硅包裹的藍藻細胞在高光照的條件下體現出更強的光合作用能力,二氧化硅殼層不僅起到了保護細胞的作用,而且有助于生物質的積累,對生物能源的利用有重要的意義.Huang等[69]還用層層自組裝的方法制備了由磷酸鈣包覆的酵母細胞,通過高溫煅燒去除酵母細胞得到粒徑均勻的磷酸鈣多孔微膠囊,可用于載藥或與其他多功能材料結合作為組織工程支架.Dzamukova等[32]報道了利用超順磁陽離子納米粒子通過單步生物相容性過程來實現在活的HeLa細胞表面的簡單功能化,磁性納米粒子被固定在細胞膜上,不會穿透細胞質.通過外部磁場的控制,被磁性納米粒子包裹的HeLa細胞可以在某些特定的位置上進行空間積累,并在這些位置進一步生長.本課題組的Wei等[95]制備了包覆WSG肽的Fe3O4納米粒(NPS),對其磁化強度與細胞相容性進行測試,并將其組裝到癌細胞的表面,結果表明包覆WSG肽的NPS具有靶向腫瘤的特性,可用于腫瘤診斷與治療領域(圖4c).

3.3 金屬納米粒子

金屬納米粒子自發(fā)現以來引起了廣泛的關注,它所具有的特殊的性質使其在生物細胞表面功能化領域占據重要的地位.不同的金屬納米粒子往往具有不同的功能,在細胞表面包裹這些納米金屬材料可以賦予細胞某些特殊的性質[96],比如金納米粒子聚集產生從紅到藍的顏色變化被用于DNA的檢測[97];納米銀粒子具有廣譜的抗菌性能在生物醫(yī)學等方面具有廣泛的應用[98];鈀納米粒子作為Suzuki反應的催化劑越來越受人關注[99].

姚成立等[100]在酵母細胞有氧呼吸的過程中結合維生素C用LBL的方法在其表面制備了銀質外殼,結果表明,制備的銀質外殼可以有效地保護酵母菌不被化學試劑毒害.Fakhrullin等[101]報道了一種用PAH/PSS在釀酒酵母和曲霉上包裹牛血清白蛋白/DNA和檸檬酸修飾的金和銀納米粒,結果表明,納米粒子有效地結合在相對帶電的聚電解質層之間,改變了細胞壁的形貌和粗糙度,并且被包裹的細胞保留了它們的生存能力.馬廣磊[102]通過加熱還原,紫外還原,水合肼還原等幾種不同的方法成功將Ag納米粒子和Pd納米粒子包載于酵母細胞和巨大芽孢桿菌細胞中.這個研究可以進一步用于將金屬納米粒子導入巨噬細胞,實現細胞內的金屬催化反應,同時酵母細胞為催化劑提供了新的生物載體,與銀結合可以形成一種新的具有良好生物相容性的抗菌材料.

3.4 生物分子

生物分子具有生物活性、生物相容性以及可降解性等天然優(yōu)勢且含有豐富的活性基團,有利于與功能基團結合,是細胞表面功能化重要的材料來源,但又因為其穩(wěn)定性低等缺點限制了它的應用與普及,所以目前關于在細胞表面進行生物分子殼化的報道并不多[71,103-105].

Drachuk等[106]展示了一種高效的封裝方法,成功將蠶絲蛋白納米殼包裹在酵母菌表面(圖5).與傳統(tǒng)的人工殼層相比,這種蠶絲蛋白納米殼層有助于細胞的初始保護,并允許它們在封裝一段時間后再被細胞完全降解.Matsuzawa等[107]將纖連蛋白和明膠形成的復合物以及Ⅳ型膠原和層粘連蛋白形成的復合物通過層層自組裝方法包裹在肝癌細胞表面,相比于傳統(tǒng)的聚電解質包裹的細胞,在離心多次后其生物活性仍是傳統(tǒng)的1.4倍.生物分子具有可降解功能和生物適應性,在細胞輸送領域具有潛在的研究價值,另外若在殼層中引入細胞生長因子也能夠提高細胞的生物活性.

圖5 用LBL方法將蠶絲蛋白納米殼包裹在酵母菌表面的示意圖[106]Fig.5 Schematic representation of silk-on-silk LbL deposition to form silkⅡrich structure on the surface of yeast cells[106]

3.5 雜化復合物

一般雜化復合物包含2種或2種以上不同的材料,因其所具有的多種功能而吸引了研究者的目光[108-110],很多研究者嘗試在生物細胞表面包裹復合物以賦予細胞多種功能.

Choi等[111]在硅酸衍生物的仿生縮聚過程中加入(3-巰基丙基)三甲氧基硅烷(MPTMS),將硫醇官能團直接摻入二氧化硅殼中,通過多肽作用將二氧化硅/二氧化鈦納米復合物固定于酵母細胞表面形成納米復合殼,殼化后的細胞不僅保持了原有的生物活性,其熱穩(wěn)定性也顯著提高(圖6),這恰恰也證明了二氧化硅和二氧化鈦的協同作用能夠賦予細胞更多的功能.此外,Choi等[112]還在酵母細胞表面構建了鞣酸與Fe3+離子形成的納米復合物殼層.這種殼層不僅能夠保護細胞免受紫外輻射、溶菌酶裂解的影響,而且還能通過降解殼層控制細胞分裂,實現化學上的"孢子形成"和"出芽生殖".姜楠等[113]在酵母細胞表面構建了由涂有L-半胱氨酸的金納米粒子和自組裝無定形二氧化硅的生物混合層組成的雙層納米殼,與傳統(tǒng)的聚電解質膜相比,該殼層有更好的生物相容性,同時它能夠導電和磁性功能化,用于保護細胞免受多種刺激.

4 細胞表面殼化的應用

由于能夠通過細胞表面殼化來賦予細胞功能的材料多種多樣,其實現的功能也各不相同,且加上不同種類細胞的特性也不同,故細胞表面殼化的應用領域也十分廣泛,包括生物、化學、能源或醫(yī)療等方面.這些領域相互交叉,根據常用領域在這里可大體分為兩大類,一類是能源、環(huán)境領域,另一類則是生物、醫(yī)學領域[114].

4.1 能源、環(huán)境領域

4.1.1 環(huán)境治理

圖6 將單個酵母細胞封裝在硫醇功能化二氧化硅(SiO2)殼內,并在SiO2殼上引入熒光素或鏈霉菌素[111]Fig.6 Encapsulation of individual yeast cells in the thiol-functionalized silica(SiO2SH)shells and the introduction of fluorescein or streptavidin onto the SiO2SHshells[111]

隨著工業(yè)的發(fā)展,環(huán)境污染問題也日益嚴重,大量含有氮、磷的廢污水造成的水華現象以及重金屬污染對人們的日常生活造成嚴重的威脅.因此如何處理好被污染的廢水成了一個難題.很多研究者將目光轉向了生物去污的方向.生物去污是一種利用生物體(例如植物[115]、微生物)將污水中重金屬離子等去除的方法,與傳統(tǒng)的治污方法相比,它的成本較低且環(huán)保有效[116-118].江慧[119]用海藻酸鈉-明膠-聚乙烯醇包埋酵母菌,并對其吸附重金屬的能力進行研究.Yang等[120]報道了一種在正常生長條件下,利用Ca2+與CO2的內源反應在酵母細胞表面制備功能性CaCO3支架的方法(圖7),并以Pb2+為例,進一步研究了功能化細胞去除重金屬的能力.實驗證明,對比普通酵母細胞,功能化的細胞對Pb2+的吸附能力要大于酵母細胞.此外,CaCO3和PbCO3之間的沉淀轉化可能只發(fā)生在功能化細胞中,最重要的是,這種方法能有效地去除水溶液中的微量雜質.這種在細胞表面構筑殼層實現功能化的方法不僅能夠提高細胞的去污能力,而且有可能實現更多的功能,例如選擇性地降解污染物、實現除污細胞的快速分離等[110],在環(huán)境保護中具有重要的應用價值.針對水華現象,盧瑞瑞[121]探究了納米材料TiO2光催化對藻類細胞(依藻,微囊藻)的影響,發(fā)現納米TiO2光催化作用在紫外光照射下比在自然光光照下對藻類細胞破壞大,而且照射時間越長破壞越大.熊威[122]則以微囊藻細胞作為模型,利用帶胺基的陽離子聚電解質,實現細胞與二氧化硅納米顆粒的快速結合.二氧化硅修飾的微囊藻細胞迅速變?yōu)榫奂瘧B(tài),并在短時間內完全沉降到水底.沉降到水底的微囊藻細胞,不僅光合生長受到抑制,而且?guī)缀跬Ｖ贯尫旁宥舅?該研究為預防水華提供了一種安全有效、成本低廉的策略.

4.1.2 生物電池

由于過度的開發(fā)濫用,能源危機日益嚴重,為滿足人們對能源的需求,生物電池應運而生.眾所周知,單細胞生物內含有大量的碳、氮化合物,是天然的碳源和氮源[123].在細胞表面功能化之后,吸附了金屬離子的生物細胞經過碳化處理可以得到金屬或金屬氧化物與碳的復合材料,這種材料具有良好的導電性,是用來制造生物電池的一種新選擇[124].Du等[125]以酵母菌作為介孔結構模板合成了Li3V2(PO4)3/C微球,其中釩陽離子與帶負電荷的親水性基團結合,分別通過靜電相互作用和代謝調節(jié)在酵母細胞壁表面和細胞內部自組裝.該微球具有較高的比表面積和合理的孔徑分布,大幅度增加了儲鋰活性,同時也縮短了鋰離子遷移和擴散的距離.Yin等[126]將酵母和石墨烯等混合在還原性氣氛下經高溫碳化得到了具有三維構造的碳/石墨烯(3D-NHPC/G)復合材料(圖8),該材料具有很高的電子傳遞能力,是制作超級電容器電極的理想材料.還有一些細胞本身就具有帶電的性質,像是某些發(fā)電的魚類[127]中與發(fā)電相關的細胞都可以進行修飾成為性能更佳的生物電池.這些生物電池利用了自然界的生物體將化學能轉化為電能,因其綠色高效得到了大家的認可,具有廣闊的應用前景[128].

圖7 內源性生成碳酸鈣納米顆粒支架的功能化細胞的形成機制[120]Fig.7 Formation mechanism of functionalized cell with endogenous production of CaCO3nanoparticle scaffold[120]

圖8 三維構造的碳/石墨烯(3D-NHPC/G)復合材料的制備工藝[126]Fig.8 Procedure for the fabrication of 3D-NHPC/G[126]

4.2 生物、醫(yī)學領域

4.2.1 細胞保護與保存

細胞的功能性外殼像件外衣,將細胞緊緊地包裹住,但同時它還具有一定的滲透性,被包裹的細胞與外界仍能進行物質交換.即使外界環(huán)境惡劣,被修飾的細胞都能在免受外界傷害的同時保持一定的活性.通過改變在細胞表面所包裹的材料種類,可以保護細胞免受多種傷害[72,94,113].Zhao等[129]通過設計納米材料作為人工細胞器,來消除細胞毒性.研究發(fā)現金寡核苷酸(Au-ODN)組成的納米復合材料可以捕獲標準化療藥物阿霉素(DOX),阻止藥物進入細胞核.體內實驗證明,Au-ODN納米材料可以選擇性地富集在肝細胞內,消除了氧化還原引起的肝毒性,提高了細胞抵抗化療環(huán)境威脅的能力(圖9).這一研究表明,將功能材料作為生物細胞器引入生命系統(tǒng),可能是保護細胞在更復雜條件下生存和制造超級細胞的新策略.Wang等[130]在斑馬魚的囊胚期成功在其表面誘導沉積了一層可以吸收紫外線的磷酸鑭鈰鋱礦化層.實驗證明,在短時間高功率和長時間低功率的紫外輻射的情況下,人工礦物殼可以有效地吸收紫外線輻射,從而保持胚胎狀況良好;相比之下,未被包膜的胚胎在此情況下無法存活.另外在細胞存儲方面,目前所常用的液氮冷凍保存的方法會對細胞造成很大的傷害,往往有部分細胞無法復蘇而凋亡,因此設想能否采用生物殼化的技術來實現細胞室溫下的長期保存[67].Wang等[131]以一株日本腦炎減毒活病毒為模型,在生理條件下,通過仿生原位礦化手段用磷酸鈣誘導病毒發(fā)生礦化,在不改變疫苗原有的生物活性及感染功能的情況下,合理設計了熱穩(wěn)定疫苗.這一實驗在疫苗的常溫保存方面有重要的意義.

圖9 Au-ODN的結構示意圖及其作為細胞內納米材料細胞器的工作原理[129]Fig.9 Schematic of construction of Au-ODN and its working principle as nanomaterials based organelle within the cell[129]

4.2.2 細胞輸送與治療

細胞治療是指利用某些具有特定功能的細胞特性,將經過生物工程手段處理過的健康細胞靶向運輸到受損器官或組織,從而達到治療疾病的目的.根據人們的需求,利用生物殼工程的手段在細胞表面形成殼層能夠提高細胞運輸的效率,而且通過在細胞表面增加功能基團能夠使細胞與藥物特異性結合,實現藥物的定點釋放,大大提高細胞治療效率.另外細胞殼化還為實現細胞的操縱治療提供了可能[110],例如,人工在干細胞表面包裹納米磷酸鈣顆粒,不僅可以保護細胞,而且可以誘導干細胞向成骨細胞分化,是一種理想的骨修復活性材料[132-133];在細胞表面引入磁性納米殼層也能夠在外加磁場作用下實現細胞治療可控地快速傳遞與分離[134];可以設計形成人造礦物外殼來包圍癌細胞,使得癌細胞與底物之間的關聯受到干擾或抑制,并由于人造礦物外殼的限制,癌細胞的運動能力會被削弱或抑制[26].Zhao等[135]提出癌細胞靶向鈣化(CCTC)的方法,選擇葉酸受體(FR)過表達的HeLa細胞,來吸附葉酸(FA)分子,然后在局部富集Ca2+,誘導特定的細胞鈣化,并由此產生的鈣礦物包裹癌細胞,誘導癌細胞死亡.研究結果表明,與傳統(tǒng)化療相比,CCTC治療可以有效抑制腫瘤生長和轉移,而不損害正常細胞.這一成果可能代表了一種用選擇性鈣化替代硬化治療腫瘤疾病的方法(圖10).Zhu等[136]選擇硫酸軟骨素作為最佳靶劑和連接劑,誘導外源Ca2+和CO32-原位生物礦化,生成靶向癌細胞膜的生物相容性碳酸鈣(CaCO3)納米結構.研究發(fā)現,生成的CaCO3納米結構可阻斷轉運蛋白,導致線粒體膜電位崩潰,乳酸脫氫酶釋放增加,最終誘導癌細胞凋亡.這一研究可能為癌癥的有效和特異性治療帶來希望.

此外,還有研究者們將殼化后具有特殊功能的細胞用于生物催化[137]、生物檢測與成像[138]、生物傳感器[139-141]和制作細胞芯片[142-143]等方面,細胞殼化在生物、醫(yī)學領域具有更為廣泛的應用價值.

圖10 (a,b)HEK293和Hela細胞經過FA選擇性介導靶向鈣化后的鈣化率;(c)經不同處理后細胞活力的定量分析(**P<0.01);(d)腫瘤小鼠經DOX和CCTC治療后的存活率(n=10)[135]Fig.10 (a,b)Calcification rate of HEK293 and Hela cells after FA selectively mediated targeted calcification anticancer therapy by CCTC;(c)Quantitative analysis of cell viability with different treatments(**P<0.01);(d)Survival rates of tumor mice after DOX and CCTC treatment(n=10)[135]

5 展 望

細胞表面殼化技術從建立到發(fā)展,盡管還不到20年的時間,但是該技術的研究極大地促進了化學、生物、材料以及醫(yī)學等領域發(fā)展.細胞表面殼化不僅可以修飾細胞,使其獲得新功能,同時也可以以細胞為模板制得新材料,還可以為揭示納米材料與細胞間的相互作用提供有效手段.細胞表面殼化技術未來前景廣闊,可以通過革新殼化技術方法、殼化材料、細胞種類、應用領域等來實現.

在細胞表面殼化技術方法上,傳統(tǒng)方法為水凝膠法和溶膠-凝膠法,可以使細胞外殼較靈活應用,后來發(fā)展為層層自組裝法和原位礦化法,能為細胞表面提供良好的機械性能和穩(wěn)定性.隨著基因編輯技術的發(fā)展,細胞可以通過插入外界基因而在細胞表面合成相應礦化相關多肽,從而被礦化修飾.此方法可以得到多種人工外殼,應用靈活,但是插入基因后細胞具有遺傳性,也必將存在生物安全性問題.除此之外,通過人工設計3D打印機可以在細胞表面打印出所需復合殼層,在細胞和組織培養(yǎng)、藥物緩釋、組織工程等領域具有巨大的應用潛力.另外,對自然界生物過程的理解也將促進殼化技術的發(fā)展,例如自然界的硅化和多巴胺的自聚合等.

在殼化材料的種類上,目前多數為聚電解質和簡單納米粒子,在材料的選擇上,最基本的要求是對細胞低毒或者無毒、不改變細胞的遺傳信息等.而隨著功能納米材料和智能聚合物的快速發(fā)展,研究者會選擇新型多功能復合納米材料應用于細胞表面殼化,例如具有雙重功能的納米材料(janus nanoparticles)或基于環(huán)境(pH、磁性、溫度、濕度以及離子強度等)響應的多功能納米粒子或納米管的復合材料.當然,使用何種材料需要根據對象細胞以及使用目的來選擇.可以預見,未來的細胞表面殼化技術不會是簡單的將納米材料沉積到細胞表面,而是需要引發(fā)細胞表面對環(huán)境變化的反應.也就是說,表面的殼層具有環(huán)境適應性強、結構多變等特性.

在殼化細胞類型上,盡管細胞殼化工程采用了所有主要分類群的細胞代表,但使用的物種數量卻非常有限.在將來,必將有新的物種細胞作為殼化的對象或模板.尤其是人類細胞的殼化將會越來越多,這與人類健康密切相關.目前有研究對部分癌細胞殼化成功且有效抑制癌細胞相關生理活動,證實細胞殼化方法在體外抑癌有效,但是在復雜的體內,殼化難度加大,尤其是能否成功靶向殼化是該技術的瓶頸.

在應用領域,細胞表面殼化技術無疑會越來越廣闊.目前,細胞表面殼化主要應用于細胞存儲、細胞保護、生物檢測、生物治療等領域.除此之外,在多種細胞表面殼化可以制造一種單一的環(huán)境,進而在研究多種單細胞的生理活動和遺傳信息等領域都具有較大的應用前景.另外,細胞表面的殼化層會影響細胞的功能性,控制殼化層的功能進而可以得到功能型細胞,或許可以誘導干細胞定向分化,產生所需要的特定功能的細胞或者組織,這將極大地促進生物、醫(yī)學學科的發(fā)展.

當然,細胞表面殼化技術目前也存在著很多問題,比如,目前多數材料對細胞有毒性、殼化后的細胞會有免疫源性、細胞對殼化的材料有一定的排斥性、外殼改變細胞某些生物學功能的機理不清楚等.因此,要解決上述問題、拓展細胞表面殼化技術領域,需要表面工程、材料科學、生物醫(yī)學、分子生物學等各個相關領域的交叉研究[144].