姚月鳳，王家勤，滑金杰，許 琦,3，張銘銘，江用文，袁海波,*，董春旺，李 佳,*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江省茶葉加工工程重點(diǎn)實驗室，浙江 杭州 310008；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081；3.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430068）

工夫紅茶是我國的傳統(tǒng)紅茶，以其外形優(yōu)美、高氣香銳、滋味鮮醇、湯色紅艷的品質(zhì)特點(diǎn)而享譽(yù)國內(nèi)外[1-2]。茶湯滋味是評價茶葉品質(zhì)的重要因子之一，在茶葉感官審評中占比30%[3]。相比非發(fā)酵茶，工夫紅茶由于其獨(dú)特的發(fā)酵工藝呈現(xiàn)出更為豐富、多元的滋味特點(diǎn)[4]。其中，“甜純”滋味是高等級工夫紅茶的關(guān)鍵品質(zhì)特征之一[3]，能降低茶湯的苦味、澀味等感官滋味，提高工夫紅茶的適口性。因此，建立工夫紅茶甜純滋味特征的客觀、準(zhǔn)確的評價體系，進(jìn)而深入研究甜純滋味的關(guān)鍵呈味物質(zhì)及其呈味特性，對工夫紅茶的品質(zhì)評價和提升具有重要意義。

目前茶湯滋味評價的主流手段是專家感官審評，該方法依賴于審評員的感官和經(jīng)驗，容易受到主觀因素和外界環(huán)境的影響，重復(fù)性較差，一定程度上限制了茶葉滋味的深入研究。電子舌技術(shù)是一種新興的基于模擬味覺傳感器的人工味覺識別技術(shù)，其原理是多個不同的味覺傳感器對所測茶湯中不同組分的響應(yīng)各異，從而獲得代表茶湯滋味特點(diǎn)的整體“指紋”信息[5]。目前，電子舌已廣泛地應(yīng)用于食品[6-8]、醫(yī)藥[9-11]、環(huán)境[12-14]等多個研究領(lǐng)域。采用電子舌分析結(jié)合化學(xué)計量學(xué)法在茶葉品質(zhì)研究領(lǐng)域已有諸多應(yīng)用，如，成功用于CTC紅茶的質(zhì)量評價[15]、不同綠茶等級的鑒定[16]等。值得注意的是，在茶湯滋味品質(zhì)的研究中，采用電子舌實現(xiàn)了對綠茶鮮味[17]、紅茶和烏龍茶的苦味、澀味的客觀評價[18]。然而，相比上述苦、澀、鮮等滋味屬性，紅茶茶湯中的甜味屬性強(qiáng)度相對較低[19]，這也給甜純滋味的客觀評價帶來一定難度。現(xiàn)有基于電子舌的茶湯滋味研究主要集中于強(qiáng)度較高的滋味屬性，目前鮮見紅茶甜純滋味屬性的研究，也鮮見工夫紅茶甜純滋味的客觀評價體系的相關(guān)報道。因此，發(fā)展基于電子舌的甜純滋味的客觀評價方法具有重要意義。

基于此，本實驗以專家感官審評為依據(jù)，圍繞甜純滋味特征，對不同工夫紅茶茶湯開展電子舌分析并結(jié)合數(shù)理統(tǒng)計手段，探索基于電子舌的甜純滋味客觀判別模型，以期為后續(xù)工夫紅茶甜純滋味特征的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究包含實驗集和驗證集2 部分工夫紅茶茶樣。研究目的是建立基于電子舌的工夫紅茶甜純滋味評價方法，因此根據(jù)專家感官審評得到的滋味特征納入茶樣。實驗集中共納入16 個工夫紅茶茶樣。其中4 個茶樣在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所制作，均以一芽二葉福鼎大白為原料，經(jīng)萎調(diào)、揉捻、發(fā)酵、干燥等工夫紅茶加工工序制成，其中發(fā)酵工藝參數(shù)略有不同（靜態(tài)發(fā)酵、不同轉(zhuǎn)速的滾動發(fā)酵），其余為商品茶。驗證集中共納入14 個工夫紅茶茶樣，均為商品茶。

1.2 儀器與設(shè)備

法國Alpha-MOS公司生產(chǎn)的ASTREE電子舌系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括Alphasoft V12控制及化學(xué)計量學(xué)軟件、16 位自動進(jìn)樣器、第5套傳感器（SRS（酸）、SWS（甜）、BRS（苦）、STS（咸）、UMS（鮮）和2 根復(fù)合味覺傳感器GPS、SPS））及一個氯化鋁參比電極。

1.3 方法

1.3.1 感官審評

取300 g茶樣置于評茶盤中，把盤，待茶葉混勻后，用大拇指、食指、中指抓取上中下3 段茶樣，稱?。?.00±0.01）g，置于審評杯中，待沸水水溫冷卻到85 ℃，向?qū)徳u杯中注滿水，加蓋，沖泡茶樣4 min后將茶湯瀝入審評杯碗[20]。冷卻至（50±2）℃后，由感官審評小組人員進(jìn)行感官審評。感官審評小組由5 位（3 男2 女）具有高級評茶員及以上資質(zhì)的審評人員組成。

1.3.2 電子舌數(shù)據(jù)采集

用1.3.1節(jié)方法進(jìn)行茶樣沖泡，茶湯趁熱過4 層紗布（150 目×10 目）倒入審評碗，冷卻至室溫（25±2）℃，待分析。每個茶樣沖泡2 次作為重復(fù)。

數(shù)據(jù)采集前，對電子舌進(jìn)行傳感器活化、校準(zhǔn)、診斷等操作，以確保檢測數(shù)據(jù)的可靠性與穩(wěn)定性。將80 mL茶湯置于容量為100 mL的電子舌專用燒杯中，樣品采集與清洗交替進(jìn)行。茶湯采集時間為120 s，清洗（純水）時間為10 s，每秒采集1 個數(shù)據(jù)。每個茶湯樣品重復(fù)測定6 次，選取后4 次穩(wěn)定的測量數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析，每次選定110～120 s時間段內(nèi)穩(wěn)定響應(yīng)信號的平均值作為輸出值。計算2 次沖泡電子舌響應(yīng)值的平均值，每個茶樣保留電子舌的4 次測量數(shù)據(jù)。檢測的環(huán)境溫度為（25±2）℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計分析采用SIMCA-P+11軟件（Umetrics，瑞典）進(jìn)行主成分分析（principal components analysis，PCA）、偏最小二乘法判別分析（partial least squaresdiscrimination analysis，PLS-DA）；采用SPSS 18（IBM，美國）進(jìn)行單因素方差分析、二元邏輯回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官審評結(jié)果

根據(jù)專家人工感官審評，將茶湯滋味定義為“甜純”、“純正”和“欠純”3 類進(jìn)行后續(xù)分析。“甜純”定義為茶湯優(yōu)勢滋味屬性為甜純、有回甘或甘和?！凹冋弊涛秳t指味道純正、無明顯雜味?！扒芳儭弊涛抖x為含有明顯的陳、酸、澀或悶味等不愉快的滋味。根據(jù)茶湯滋味特點(diǎn)的差異，將實驗集16 個工夫紅茶分類。其中甜純組、純正組和欠純組分別包含7、5 個和4 個茶樣（表1）。

表1 實驗集工夫紅茶茶樣感官審評結(jié)果及組別Table 1 Taste sensory evaluation and classification of Congou black tea samples in experimental set

2.2 電子舌檢測的重復(fù)性分析

為保證實驗的可靠性和穩(wěn)定性，從甜純組、純正組、欠純組中分別任意選取一個茶樣A、B、C，均沖泡3 次，按1.3.2節(jié)進(jìn)行電子舌數(shù)據(jù)的采集。如表2所示，7 個傳感器的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=12）在0.09%～4.38%之間，顯示茶湯沖泡和電子舌檢測的重復(fù)性良好。

表2 電子舌7 個傳感器響應(yīng)值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 RSD of responses of seven sensors%

2.3 電子舌對甜純、純正、欠純茶湯響應(yīng)的多變量分析

為了快速、直觀地分析電子舌對不同滋味特征（甜純、純和、欠純）工夫紅茶茶湯的響應(yīng)差異，首先采用PCA對電子舌數(shù)據(jù)進(jìn)行總覽。PCA是一種基于數(shù)據(jù)降維的非監(jiān)督多變量統(tǒng)計分析手段，可客觀地反映原始變量的信息并進(jìn)行線性分類[21]。如圖1A所示，PC1為83.35%，PC2為11.93%，前2 個主成分代表了樣本中95.28%的信息，表明PCA模型可以綜合反映電子舌數(shù)據(jù)。3 類不同滋味的工夫紅茶茶湯在PCA得分圖上得到較為明顯的區(qū)分。甜純組與純正組、欠純組茶湯存在顯著差異，在PC1方向上分開（PC1=83.35%）；而純正組與欠純組間差異則相對較小，在PC2方向上得到區(qū)分（PC2=11.93%）。盡管感官審評表明12#茶樣的主要滋味屬性為甜純，然而由于其稍帶煙味，顯著影響了電子舌的響應(yīng)“指紋”，使得12#茶樣在圖1A上遠(yuǎn)離其他甜純組的樣品而接近純正組與欠純組的茶樣。類似地，甜純組14#茶樣由于其滋味“稍帶果味”也在圖1A上較遠(yuǎn)離其他甜純組茶樣。上述結(jié)果表明，電子舌分析可基本客觀地反映不同的茶湯滋味。然而，對個別滋味屬性較為復(fù)雜的樣本，電子舌分析所識別的滋味特點(diǎn)與人工感官仍有一定差別。紅茶茶湯中成分眾多，互作復(fù)雜。電子舌的味覺傳感器陣列由選擇性各異的一系列傳感器所組成，傳感器的數(shù)量有限，難以完全模擬人類味蕾[22]。12#茶樣在人工感官審評中為“甜純，稍帶煙”，優(yōu)勢滋味為甜純；而傳感器顯示其滋味為非甜（純正或欠純），其原因可能是，相比人工感官，傳感器可能對茶湯中煙味分子較為敏感。因此在后期大規(guī)模樣本的建模研究中，應(yīng)以科學(xué)的感官審評為依據(jù)，對“稍帶煙”的茶樣建立更加嚴(yán)格的納入標(biāo)準(zhǔn)，同時進(jìn)一步明確該類茶樣的電子舌響應(yīng)規(guī)律，從而提高模型準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

為探索電子舌檢測能否用于工夫紅茶茶湯滋味的判別，以電子舌7 個傳感器響應(yīng)值為X變量，以茶湯滋味分組（甜純、純正、欠純）為Y變量做PLS-DA。PLS-DA是一種有監(jiān)督的模式識別方法，相對于PCA所得的投影通?？色@得更好的分類效果[23]。如圖1B所示，3 類（甜純、純正、純）茶湯的聚類結(jié)果類似于PCA的結(jié)果（R2X=1，R2Y=0.61，Q2=0.512）。Q2大于0.5，表明模型具有較好的預(yù)測能力[24]。過擬合是PLS-DA模型的一個常見問題[25]。為進(jìn)一步驗證PLS-DA模型的可靠性，對該模型進(jìn)行置換檢驗驗證（圖1C）。將模型建立時定義的Y矩陣的變量隨機(jī)排列100 次，得到R2和Q2截距分別為（0.0，0.029）和（0.0，-0.399），表明PLS-DA模型穩(wěn)定可靠，未存在過擬合，可用于不同滋味的判別。

圖1 實驗集甜純、純正、欠純3 類工夫紅茶茶湯電子舌響應(yīng)值的PCA得分圖（A）、PLS-DA得分圖（B）和置換檢驗圖（C）Fig. 1 PCA score plot (A) and PLS-DA score plot (B) for electronic tongue analysis of Congou black tea infusions with three different taste characteristics in experimental set and cross-validation of PLS-DA model (C)

2.4 影響甜純滋味識別的關(guān)鍵傳感器篩選

為進(jìn)一步探明電子舌7 根傳感器的響應(yīng)值對滋味分組的貢獻(xiàn)，篩選出影響甜純滋味識別的關(guān)鍵傳感器，將上述PLS-DA模型做載荷分析。如圖2所示，對甜純滋味識別影響較大的變量可能為SWS（甜）、UMS（鮮）、SPS（綜合），其w×c值分別為0.47、0.42、0.42，以變量SWS（甜）貢獻(xiàn)為最大。進(jìn)一步采用變量投影重要性（variable important for the projection，VIP）篩選關(guān)鍵差異變量，如圖3所示。結(jié)果表明，VIP值大于1.0的變量包括SWS（甜）、GPS和SPS（復(fù)合味覺）及BRS（苦），其中以SWS（甜）的VIP值為最高。SWS甜味傳感器對甜純組茶湯的響應(yīng)顯著高于純正組和欠純組（P＜0.001），而對于純正組和欠純組的響應(yīng)差異則不顯著（圖4）。上述結(jié)果表明SWS甜味傳感器可能是識別甜純滋味的關(guān)鍵因子。

電子舌傳感器陣列中包含的多個傳感器不是單一物質(zhì)味覺敏感傳感器，每根傳感器對多種物質(zhì)具有交互的味覺敏感性但靈敏度各異[5]，推測SWS傳感器可能對工夫紅茶茶湯中的甜純特征的呈味物質(zhì)靈敏度較高，而對苦、澀類物質(zhì)的靈敏度較低。目前鮮見工夫紅茶茶湯中甜味物質(zhì)的研究報道。對大吉嶺紅茶等其他茶葉的研究揭示葡萄糖、蔗糖、丙氨酸、鳥氨酸、茶氨酸、茶黃素等具有甜味的滋味特點(diǎn)[19,26-27]。電子舌傳感器陣列對工夫紅茶茶湯中組分的響應(yīng)規(guī)律，及工夫紅茶的甜純特征成分仍有待研究。

圖2 PLS-DA因子載荷圖Fig. 2 Loading plot of PLS-DA model

圖3 實驗集3 類（甜純、純正、欠純）茶湯的電子舌綜合響應(yīng)PLS-DA的VIP圖Fig. 3 VIP plot of PLS-DA model

圖4 電子舌SWS甜味傳感器對3 類（甜純、純正、欠純）工夫紅茶茶湯的響應(yīng)柱狀圖Fig. 4 Bar plot of signal responses of SWS sensors to tea infusions with three different taste characteristics in experimental set

2.5 基于電子舌的甜純滋味特征判別預(yù)測方程的建立

為實現(xiàn)對工夫紅茶茶湯滋味甜純與否的快速、準(zhǔn)確判別，對電子舌7 個傳感器響應(yīng)值的數(shù)據(jù)進(jìn)行二元邏輯回歸分析，以篩選關(guān)鍵判別因子并建立判別方程。采用“向前逐步選擇法”僅篩選出1 個建立最優(yōu)預(yù)測模型所需的變量，為SWS（甜），驗證了PLS-DA載荷分析和VIP值的結(jié)果?；诖?，建立判別預(yù)測方程為（p為預(yù)測甜純滋味的概率；X為SWS甜味傳感器響應(yīng)值）。p值大于0.5表示樣品預(yù)測為甜純組；反之則為非甜純的茶湯（純正或欠純）。如圖5所示，基于該預(yù)測方程，非甜純茶湯的滋味歸屬均預(yù)測正確，甜純茶湯中除了12#茶樣外均預(yù)測正確，預(yù)測準(zhǔn)確率為93.8%。12#茶樣由于其滋味“甜純，稍帶煙”，顯著影響了電子舌的響應(yīng)，被預(yù)測為非甜純的茶湯，與PCA和PLS-DA結(jié)果一致。剔除該異常樣本后，預(yù)測準(zhǔn)確率為100%。

圖5 基于二元邏輯回歸分析預(yù)測的茶湯滋味歸屬的預(yù)測概率散點(diǎn)圖Fig. 5 Scatter plot for predicted probability of tea taste assignment using binary logistic regression analysis

2.6 電子舌用于甜純滋味識別的進(jìn)一步驗證

為進(jìn)一步驗證實驗集的結(jié)果，收集14 個工夫紅茶作為驗證集進(jìn)行專家感官審評和電子舌分析。如表3所示，甜純、純正和欠純組分別包含4、5、5 個茶樣。

甜純、純正和欠純3 類茶湯的電子舌“指紋”在PCA得分圖（PC1=50.40%，PC2=30.67%）上各自展現(xiàn)出清晰的聚類（圖6A），表明電子舌傳感器對甜純、純正和欠純3 類茶湯中溶液分子的響應(yīng)存在顯著差異。進(jìn)一步地，PLS-DA模型也可實現(xiàn)對驗證集中3 類不同滋味工夫紅茶的有效判別（圖6B）。模型R2X=0.869，R2Y=0.922，Q2=0.914，表明PLS-DA模型在驗證集樣本中具有良好的預(yù)測能力。置換檢驗驗證（100 次置換檢驗）結(jié)果顯示，R2和Q2截距分別為（0.0，0.006 73）和（0.0，-0.35），表明模型穩(wěn)健、未存在過擬合現(xiàn)象（圖6C）。進(jìn)而對模型分組貢獻(xiàn)最大的關(guān)鍵變量為SWS甜味傳感器（圖6D）。驗證集的多變量分析結(jié)果與上述實驗集得出的結(jié)論一致，再次證明了電子舌可用于工夫紅茶甜純滋味特征的快速檢測和識別。

表3 驗證集工夫紅茶茶樣感官審評結(jié)果及組別Table 3 Taste sensory evaluation and assignments of Congou black tea samples in validation set

圖6 驗證集甜純、純正、欠純?nèi)惞し蚣t茶茶湯電子舌響應(yīng)值的PCA得分圖（A）、PLS-DA得分圖（B）、置換檢驗圖（C）和PLS-DA因子載荷圖（D）Fig. 6 PCA score plot (A) and PLS-DA score plot (B) for electronic tongue analysis of Congou black tea infusions with three different taste characteristics in validation set, cross-validation of PLS-DA model (C),and loading plot of PLS-DA model (D)

3 結(jié) 論

本研究圍繞高品質(zhì)工夫紅茶的甜純滋味特征，以專家感官審評為依據(jù)，開展基于電子舌的茶湯甜純特征的客觀評價研究。結(jié)果表明，利用電子舌的響應(yīng)“指紋”結(jié)合多元統(tǒng)計分析手段，可實現(xiàn)對工夫紅茶甜純滋味的客觀、有效判別。電子舌中的SWS甜味傳感器是甜純滋味判別的關(guān)鍵因子?；诙壿嫽貧w建立的甜純滋味判別方程，預(yù)測準(zhǔn)確率達(dá)93%以上。因此，本研究提供了一種基于電子舌的工夫紅茶甜純滋味特征的快速、準(zhǔn)確的判別評價手段，可作為專家感官審評的輔助或補(bǔ)充，亦可為茶湯滋味的客觀、智能評價提供依據(jù)?；诒狙芯?，深入研究電子舌傳感器陣列對工夫紅茶復(fù)雜茶湯組分的響應(yīng)機(jī)制，探索工夫紅茶甜純滋味的物質(zhì)基礎(chǔ)，對于工夫紅茶滋味品質(zhì)的提升和調(diào)控具有積極的意義。