徐明芳，陳耕南，沈林燕，王洋洋，李 彥，黃曉晶

（暨南大學生命科學技術學院，廣東 廣州 510632）

VD是人類和動物在成長過程中不可或缺的一種維生素，是人體生長發(fā)育所需的一種類固醇激素，作為細胞核類固醇家族成員，具有調節(jié)人體鈣與磷代謝，影響細胞增殖分化，促進骨骼與牙齒的形成，維持血液中氨基酸濃度平衡等作用[1-2]。VD作為固醇類的衍生物，動物體內VD3或膽鈣化醇由7-脫氫膽固醇經紫外線照射而轉變；VD2或鈣化醇則由植物或真菌麥角固醇光轉化合成，兩種VD在人體內具有相同的生理作用。人體若VD攝取不足，易導致小兒佝僂病、嬰兒手足抽搐癥、軟骨病及老年人骨質疏松。2010年流行病學研究發(fā)現(xiàn)，我國老年骨質疏松發(fā)病率高于發(fā)達國家2 倍以上，90%以上老年人群中VD缺乏嚴重，目前醫(yī)學研究還表明VD缺乏還是導致癌癥、自發(fā)性免疫疾病、傳染病、心血管疾病和精神疾病等多發(fā)疾病的危險因素[3-6]。

圖1 麥角固醇（A）和VD2（B）結構式Fig. 1 Chemical structures of ergosterol (A) and VD2 (B)

麥角固醇是以環(huán)戊烷多氫菲（甾核）為骨架的甾醇類化合物，廣泛存在于食用菌、酵母等真菌中[7-8]，植物中的麥角固醇除非經過紫外光照射合成VD2，否則很難被人體吸收利用[9-11]，麥角固醇與VD2結構式如圖1所示。不同種類食用菌麥角固醇的含量不同，大多數野生或栽培食用菌都富含麥角固醇，麥角固醇是食用菌中含量最高的甾醇，含量最高達食用菌干質量的0.6%～0.7%，占食用菌中所有甾醇含量的83%～89%[12-15]。麥角固醇經紫外光照射時，分子中一個碳環(huán)C9和C10發(fā)生斷裂可轉化為VD2，麥角固醇是VD2的前體化合物，是很好的VD2來源，兩者為同分異構體[16]（圖1）。

天然食物中VD2含量有限，僅存于野生食用菌、酵母等真菌中，在植物和動物中麥角固醇和VD2含量很低[17]。Jasinghe等[18]研究表明，香菇、平菇、雙孢菇和鮑魚菇4 種野生食用菌樣品經紫外光照射后，VD2含量隨之變化顯示差異性，其中平菇中VD2含量最高。我國是食用菌生產和消費大國，產量占世界總產量的70%。平菇由于子實體生長速度快周期短，是食用菌中產量與消費量最高的品種。平菇（Pleurotus ostreatus）屬擔子菌門（Basidiomycota）、層菌綱（Hymenomycetes）、傘菌目（Agaricales）、側耳科（Pleurotaceae）、側耳屬（Pleurotus）[19]，富含多糖、多酚等生物活性物質，具有抗氧化[20-22]和降血糖[23-24]等保健功能，目前研究多集中平菇食用菌多糖。麥角固醇是平菇重要的植物甾醇，已引起業(yè)界廣泛關注，然而，平菇體子實體內麥角固醇光轉化為VD2的研究很少。本實驗從5 個原種菌株搖瓶篩選高產麥角固醇平菇菌株，通過子實體培養(yǎng)及其體內麥角固醇光促轉化為VD2的研究，旨在提高平菇的藥食價值，為富含維生素食用菌作為原料開發(fā)特膳功能食品的研究提供理論支持，具有重要的現(xiàn)實意義及廣泛應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗菌種（編號為P10、P40、PL-39、P831、沙白等5 個平菇菌株） 廣東省微生物研究所菌種保藏中心。

麥角固醇標準品、VD2標準品、VB1美國Sigma公司；磷酸二氫鉀（KH2PO4）、無水乙醇、氫氧化鈉（NaOH）、磷酸二氫鈉、硝酸銨 廣州化學試劑廠；麥芽糖、乳糖、麩皮、尿素 美國Amresco公司；蛋白胨、酵母粉 英國Oxoid公司；葡萄糖、蔗糖、硫酸鎂（MgSO4）、石油醚、戊二醛、磷酸氫二鈉、四氧化鋨、乙酸異戊酯 天津市大茂化學試劑廠；化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

1100高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀及數據處理平臺 美國Agilent公司；HPLC柱COSMOSIL 5C18-MS-II（4.6 mm×250 mm，5 μm） 上海普譽科貿有限公司；Ultra 55 FESEM場發(fā)射電子顯微鏡 德國Zeiss公司；Leica EM CPD300CO2全自動臨界點干燥儀 德國Leica公司；SCD 005 Sputter Coater離子濺射儀、UV-1750紫外分光光度計 日本津島儀器公司；Thermo Scientific超純水儀 美國Thermo公司；RE-2000B旋轉蒸發(fā)儀上海亞榮生化有限公司。

1.3 方法

1.3.1 平菇菌絲體與子實體培養(yǎng)方法

1.3.1.1 平菇菌種活化

菌種活化固體培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯200 g去皮煮汁，加入葡萄糖20 g、KH2PO41 g、MgSO41.5 g、瓊脂粉20 g、VB10.01 g、水1 000 mL。

保藏菌種用接種環(huán)接種于PDA培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，菌株菌絲潔白濃密、菌絲爬壁力強及生長健壯，可作為種子用于后續(xù)搖瓶培養(yǎng)。

1.3.1.2 母種制備與種子搖瓶培養(yǎng)

母種制備與種子搖瓶培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g去皮煮汁，加入葡萄糖20 g、大豆粉2 g、KH2PO42 g、MgSO41 g、VB10.01 g、水1 000 mL，常規(guī)分裝，121 ℃高壓滅菌30 min。

母種制備：從PDA培養(yǎng)基中切取潔白健壯的菌絲于250 mL裝有100 mL液體培養(yǎng)基的三角錐瓶中，菌絲生長最適溫度25 ℃，150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)6 d，作為母種待用。

子實體接種種子制備：從母種中抽取10%接種于500 mL裝有200 mL液體培養(yǎng)基的三角錐瓶中，25 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)6～7 d，作為子實體接種種子待用。

1.3.1.3 平菇子實體培養(yǎng)

將稱取好的栽培料200 g（其中棉籽殼86%、麩皮10%、石膏2%、石灰2%）加入適量的水（含水量控制約65%）攪拌均勻裝袋，120 ℃、高壓滅菌2 h；冷卻后無菌接種，控制溫度22 ℃培養(yǎng)40～60 d，菌絲長滿栽培袋后分化出菇形成子實體。

1.3.2 細胞干質量法測定平菇菌絲體生物量[25]

發(fā)酵液過濾后，菌絲體用超純水充分洗滌，50 ℃干燥至恒質量，電子天平準確稱質量，按下式計算生物量：

式中：m為細胞干質量/mg；V為取樣體積/L。

1.3.3 樣品中麥角固醇與VD2的提取方法

樣品干燥后碾磨成粉末，取0.1 g于磨口圓底燒瓶中，加入25 mL 15% NaOH溶液、50 mL無水乙醇及4 mL含抗壞血酸鈉的NaOH溶液（17.5 g抗壞血酸鈉溶于100 mL 1 mol/L的NaOH溶液），85 ℃水浴加熱1.5 h，冷卻至室溫，加入25 mL石油醚，劇烈振蕩，靜置分層，取上清液，復提下層2 次，合并上清液。上清液中加入5 g無水硫酸鈉，過濾。濾液置于45 ℃的旋轉蒸發(fā)儀中，經3～4 h蒸至近干，乙醇定容至5 mL，0.45 μm濾膜過濾，上樣待測。

1.3.4 HPLC檢測麥角固醇與VD2含量

采用HPLC法同步測定實驗樣品中麥角固醇及VD2的含量。HPLC的分離條件：色譜柱：COSMOSIL 5C18-MS-II（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：100%甲醇；流速：1.0 mL/min；進樣量：5 μL；柱溫：30 ℃；二極管陣列檢測器，檢測波長：270 nm。

準確量取麥角固醇、VD2標準品，用無水乙醇稀釋成一系列濃度的混合標準溶液待測，以麥角固醇、VD2濃度為橫坐標，相應峰面積為縱坐標制成標準曲線。計算麥角固醇的標準曲線為y=6.576 6x-15.937，R2=0.999；VD2標準曲線為y=6.207x+17.481，相關系數R2= 0.999 6。

由HPLC法測定得到峰面積，根據標準曲線換算得到樣品中麥角固醇、VD2濃度，其含量計算公式如下：

式中：c1、c2分別為麥角固醇、VD2的質量濃度；V1、V2分別為麥角固醇、VD2的定容體積；N1、N2分別為麥角固醇、VD2的稀釋倍數；m1、m2分別為萃取麥角固醇、VD2樣品的干質量。

1.3.5 菌絲體搖瓶培養(yǎng)基優(yōu)化實驗設計

1.3.5.1 Plackett-Burman試驗設計

采用Plackett-Burman試驗設計進行顯著因素的篩選，對葡萄糖（A）、蛋白胨（B）、蔗糖（C）、黃豆粉（E）、MgSO4（G）、KH2PO4（H）和VB1（I）7 個因素和2 個虛擬變量[26-28]進行Plackett-Burman試驗設計。每個因素取2 個水平，高水平（1）、低水平（-1），以平菇菌絲體麥角固醇含量（mg/g）為響應值。各因素與水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設計因素與水平Table 1 Levels and factors used for Plackett-Burman design

1.3.5.2 最陡爬坡試驗方法

根據Plackett-Burman試驗結果中以顯著因素的效應大小確定最陡爬坡試驗的方向和梯度，為后續(xù)Box-Behnken試驗確定中心點數據。

1.3.5.3 Box-Behnken響應面試驗優(yōu)化

根據Plackett-Burman試驗和最陡爬坡試驗中確定的顯著因素和中心點，采用Box-Behnken法進行3因素3水平的響應面優(yōu)化，以獲取最佳培養(yǎng)基配方，各因素水平設置見表2。

表2 Box-Behnken試驗因素與水平Table 2 Levels and factors used for Box-Behnken design

1.3.6 子實體培養(yǎng)基優(yōu)化實驗方法

每袋200 g子實體栽培培養(yǎng)基中（1.3.1.4節(jié)）分別調整葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、豆粉、蛋白胨、KNO3、尿素等組分優(yōu)化子實體栽培培養(yǎng)基，優(yōu)勢菌株接種后經40 d左右培養(yǎng)分化出菇，分別采集成熟子實體，在60 ℃烘箱中烘干至恒質量，以實體干質量作為子實體生物量，并測定麥角固醇含量。

1.3.7 平菇子實體紫外光照實驗方法

紫外燈（管長60 cm、功率30 W、波長254 nm、光照強度0.45 mW/cm2）固定于自行設計的光照培養(yǎng)箱架子上，受試物垂直照射距離設置40 cm。選取子實體發(fā)育完全、菌蓋未開傘平菇子實體，分離的菌蓋菌褶與菌柄在不同照射時間下進行紫外光照實驗，非照射處理為對照組，實驗重復3 次。

1.3.8 平菇子實體微觀結構電鏡分析

蒸餾水洗滌樣品3 次，4%戊二醛固定液中固定48 h，0.2 mol/L磷酸緩沖液漂洗3 次，1%四氧化鋨固定2 h，乙醇梯度脫水（分別為30%、50%、70%、85%、90%乙醇各1 次，100%乙醇2 次，15 min/次），乙酸異戊酯置換乙醇2 次（20 min/次），8 000 r/min離心5 min。制備樣品置于CO2臨界點干燥儀中干燥，離子濺射儀內完成80 s噴金處理，采用FEM場發(fā)射掃描電子顯微鏡分析樣品的微觀結構特征。

1.4 數據處理與分析

采用Design Expert 8.0軟件對所得數據進行分析，Origin 8.0軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 HPLC法同步檢測麥角固醇與VD2技術方法建立

優(yōu)化了檢測波長（265、270、280 nm）、流動相（甲醇-水比例）、柱溫（25、30、35、40 ℃）和流動相流速（0.5～1.2 mL/min）。當最佳分離條件確立為波長270 nm、100%甲醇、柱溫30 ℃、流速1 mL/min、進樣量5 μL時，色譜圖中麥角固醇與VD2單標與混標色譜峰實現(xiàn)完全分離（圖2），峰形尖銳對稱，保留時間穩(wěn)定，圖譜基線平穩(wěn)，所有樣品在15 min內檢測完畢。

圖2 VD2、麥角固醇單標（A）和混合標準溶液（B）HPLC色譜圖Fig. 2 HPLC chromatograms of vitamin D2 and ergosterol standards

配制6 份相同濃度的標準麥角固醇、VD2混合溶液在上述優(yōu)化色譜條件下分別進樣檢測，按照測量值和真實值計算回收率，考察該檢測方法的精密度，結果見表3所示。樣品麥角固醇、VD2平均回收率分別為99.06%與97.77%；相對標準偏差分別為2.93%與5.54%。

表3 麥角固醇與VD2的加標回收率Table 3 Recoveries of ergosterol and VD2 from spiked samples

如圖3A所示，標準品麥角固醇與VD2分別在13.5、10.4 min出峰，峰形尖銳對稱，基線平穩(wěn)無干擾。

圖3 麥角固醇與VD2標準品（A）、平菇樣品（B）HPLC譜圖Fig. 3 Chromatograms of standard solutions (A) and P. ostreatus sample (B)

如圖3B所示，平菇樣液中麥角固醇與VD2分別在13.3、10.4 min出峰，峰后有少許雜峰但不影響麥角固醇與VD2的定性定量分析，與圖3A相比。平菇樣品與標準品相應的位置上有相同的色譜峰，主峰與其他色譜峰之間分離關系良好，表明檢測體系系統(tǒng)適用性較好，可作為同步檢測平菇麥角固醇與VD2含量的關鍵技術方法。

2.2 高產麥角固醇平菇優(yōu)勢菌株的篩選

2.2.1 菌絲體的生物量與麥角固醇含量差異性

表4 5 種不同菌株菌絲體的生物量及麥角固醇含量Table 4 Mycelial biomass and ergosterol content of fi ve different strains of P. ostreatus

從表4可看出，5 種平菇菌絲體生物量和麥角固醇含量差異較大，P831和P40菌絲體生物量較高，分別超出均值的20.4%、37.7%，尤其是P831麥角固醇含量可達3.25 mg/g，高于其他菌株1.0～3.0 倍，說明不同菌株對麥角固醇含量影響較大[23]，P831確定為優(yōu)選菌株。

2.2.2 子實體生物量與麥角固醇含量差異性

5 株菌株子實體生物量和麥角固醇含量差異性也較大，結果如表5所示，與平菇P10、P40、PL-39及沙白菌株相比，P831子實體中麥角固醇含量最高，可達到2.05 mg/g。

表5 5 種不同菌株子實體的生物量及麥角固醇含量Table 5 Fruit body biomass and ergosterol content of fi ve different strains of P. ostreatus

P40雖然生長快子實體生物量最高，但其菌絲體與子實體麥角固醇差異較大，由于菌絲體與子實體培養(yǎng)時間約60 d，基于P831在菌絲體與子實體培養(yǎng)中顯示的穩(wěn)定性最終確定為優(yōu)選菌株。

2.3 平菇菌絲體培養(yǎng)基成分響應面法優(yōu)化

2.3.1 單因素對菌絲體生物量及麥角固醇含量影響

菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)基中，碳、氮源是關鍵成分，碳、氮源是菌體維持細胞生命活動所需的物質，提供細胞能源及各種代謝產物的骨架，構成生物體蛋白質、核酸與甾醇等代謝物的材料，對于菌絲體生物量及麥角固醇含量具有較大的影響。不同碳、氮源對平菇菌絲體產麥角固醇的影響結果如圖4所示，其中蔗糖、蛋白胨對菌絲體麥角固醇含量的影響最大，因此，選擇蔗糖、蛋白胨作為高產麥角固醇的碳、氮源。

圖4 不同碳源（A）、氮源（B）對平菇菌絲體生物量及麥角固醇含量的影響Fig. 4 Effects of different carbon sources (A) and nitrogen sources (B)on mycelial biomass and ergosterol content of P. ostreatus

2.3.2 響應面分析法優(yōu)化平菇菌絲體培養(yǎng)基成分

由表6、7可知，對平菇菌絲體麥角固醇含量具有顯著影響的組分是蛋白胨、KH2PO4、蔗糖（P＜0.05），而MgSO4、VB1對平菇菌絲體麥角固醇含量影響具有負效應，確定蛋白胨、KH2PO4及蔗糖為3 個關鍵影響因素。

表6 Plackett-Burman試驗設計和結果Table 6 Experimental results of Plackett-Burman design

表7 Plackett-Burman試驗因素及顯著性分析Table 7 Signi fi cance test of Plackett-Burman design

根據Plackett-Burman試驗結果，對具有正效應的3 個顯著因素蛋白胨、蔗糖、KH2PO4設計最陡爬坡試驗，確定菌絲體產麥角固醇液體培養(yǎng)基中關鍵因素的濃度水平。如表8所示，當蛋白胨0.35%、蔗糖3.48%、KH2PO40.35%時，麥角固醇最大響應值為3.324 mg/g。

表8 最陡爬坡試驗設計及結果Table 8 Experimental results of steepest ascent path design

根據最陡爬坡試驗結果，以麥角固醇含量為響應變量Y，以蛋白胨質量分數0.35%（X1）、蔗糖質量分數3.5%（X2）、KH2PO4質量分數0.35%（X3）為Box-Behnken設計的中心點，進行3因素3水平的Box-Behnken設計試驗，優(yōu)化菌絲體高產麥角固醇液體培養(yǎng)基組分。不同液體培養(yǎng)基組成對菌絲體麥角固醇含量的影響結果如表9所示。

對表9中菌絲體麥角固醇含量進行回歸分析，以麥角固醇含量為響應變量Y，以蛋白胨質量分數（X1）、蔗糖質量分數（X2）、KH2PO4質量分數（X3）為自變量X的二次多項回歸方程：

Y=3.53-0.055X1-0.018X2-0.011X3+0.26X1X2+0.079X1X3-0.045X2X3-0.45X12-0.45X22-0.56X32

由表10方差分析結果可知，二元回歸模型具有極顯著性（P＜0.01極顯著），失擬誤差P=0.023 7（P＜0.05顯著），回歸方程和擬合度置信度均較高。

表9 Box-Behnken試驗設計及結果Table 9 Experimental results of Box-Behnken design

表10 回歸模型的方差分析Table 10 Analysis of variance of quadratic polynomial regression model

通過對回歸模型分析知，響應面法優(yōu)化平菇P831菌絲體產麥角固醇的培養(yǎng)基最佳配比為蛋白胨0.35%，蔗糖3.48%，KH2PO40.35%。在此條件下，模型預測平菇菌絲體中麥角固醇含量達3.53 mg/g, 而實測值為3.64 mg/g，相對誤差為2.995%，驗證了響應面法預測模型所得結果的可靠性，表明在此條件下該模型具有可預測性。

2.4 栽培料中碳、氮源對子實體生物量與麥角固醇含量的影響

每袋200 g子實體栽培料中，不同碳、氮源量對子實體生物量與麥角固醇含量的影響如圖5所示，與對照組（CK）相比，添加了KNO3、葡萄糖、豆粉、尿素的培養(yǎng)基有利于子實體的生長，其中KNO3對子實體產生物量影響最大，而當栽培料中添加蛋白胨、麥芽糖時，子實體生物量相對較低（圖5A）。

圖5 栽培料對子實體生物量（A）與麥角固醇含量（B）的影響Fig. 5 Effects of different medium components on biomass and ergosterol content of fruit body

由圖5B可知，添加尿素、蔗糖與豆粉的培養(yǎng)基可增加子實體中麥角固醇的含量，其中尿素影響最大，此時麥角固醇含量最高達3.81 mg/g，而蛋白胨、葡萄糖、KNO3、麥芽糖對子實體麥角固醇的含量影響不大。

2.5 平菇子實體內麥角固醇光轉化VD2

子實體是平菇的繁殖器官，基本結構由菌蓋菌褶與菌柄組成。對平菇子實體不同部位經紫外光照射處理，菌蓋菌褶與菌柄中麥角固醇與VD2含量結果如表11所示。

表11 平菇不同部位麥角固醇光化VD2含量差異性Table 11 Ergosterol and vitimin D2 contents in different fruit body parts of P. ostreatus

平菇未經紫外照射的情況下，菌蓋中麥角固醇含量高于菌柄，此時均未檢測到VD2；經過20 min的紫外照射后，菌蓋和菌柄中均檢測到VD2，其中菌蓋中麥角固醇及VD2含量均高于菌柄，雖然菌蓋、菌柄中麥角固醇含量變化不明顯，但VD2卻有顯著變化，這與麥角固醇經紫外照射轉化為VD2有關[29]。

食用菌體中麥角固醇光促轉化為VD2反應機理如圖6所示，紫外光照射對麥角固醇光轉化VD2有顯著影響，麥角固醇是真菌細胞膜中的重要組成成分，共有15 個酶反應參與其生物合成代謝途徑[30]，紫外光轉化過程中主要產物的相互關系[31]。

圖6 麥角固醇紫外光轉化VD2示意圖[31]Fig. 6 Schematic illustration of UV-induced transformation of ergosterol into VD2

圖7 平菇不同部位掃描電鏡圖Fig. 7 Morphological characteristics of different fruit body tissues of P. ostreatus observed by FESEM

麥角固醇在光催化反應中，除生成有活性的VD2前體和VD2外，長時間的紫外光照，還會生成多種無效價的同分異構體，如光甾醇（L）和速甾醇（T）等副產物[29,32]。但目前尚未發(fā)現(xiàn)麥角固醇與VD2含量之間轉化的相關性研究。實驗證實，光照射時間40 min以上，平菇色澤出現(xiàn)由白向深黃褐的轉變，說明子實體組織結構出現(xiàn)光損傷，對于平菇而言，將嚴重影響其外觀。

麥角固醇是真菌細胞膜中的重要組成成分，大量存在于食用菌細胞質膜上，多以自由態(tài)存在于真菌細胞膜的磷脂雙分子層中。圖7電鏡結果顯示，平菇子實體菌蓋中含有大量菌絲體與成喙狀突起的鎖狀結構，菌蓋菌褶中致密的菌絲孢子和菌柄中管狀纖維網絡結構（未見孢子）這兩種組織結構存在微觀差異性，平菇中麥角固醇與VD2含量從上面菌蓋菌褶到下面菌柄呈遞減趨勢，而平菇食用菌絲體中鎖狀結構和子實體中孢子是細胞分裂能力、新陳代謝旺盛的主要組織結構，推測麥角固醇與VD2含量與組織形態(tài)結構與細胞新陳代謝能力有相關性。

3 結 論

5 個篩選的實驗菌株中，菌株P831麥角固醇含量高于其他菌株1.0～3.0 倍，確定為優(yōu)勢菌株。

響應面法優(yōu)化平菇菌絲培養(yǎng)基關鍵組分，當菌絲培養(yǎng)基中蛋白胨為0.35%、蔗糖為3.48%、KH2PO4為0.35%時，平菇P831菌絲體麥角固醇含量達到3.64 mg/g，與回歸方程預測值3.5 mg/g相比，相對誤差為2.995%。

子實體培養(yǎng)基優(yōu)化實驗中發(fā)現(xiàn)，尿素有促進子實體生長及提高麥角固醇含量作用。

平菇子實體不同組織結構中VD2含量在紫外光作用下有較大的差異，菌蓋菌褶中麥角固醇與VD2含量明顯高于菌柄，電鏡結果顯示菌蓋菌褶中致密的菌絲孢子和菌柄中管狀纖維網絡結構的微觀差異性，推測麥角固醇與VD2含量差異與組織形態(tài)結構與細胞新陳代謝能力有關。