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        刺參體壁胰/類胰絲氨酸蛋白酶的性質(zhì)及其在自溶中的作用

        2019-10-08 03:48:42徐錦華孟澤玲葛詩(shī)琪張公亮侯紅漫孫黎明
        食品科學(xué) 2019年18期

        徐錦華,孟澤玲,葛詩(shī)琪,薛 鵬,張公亮,侯紅漫,孫黎明,*

        (1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧 大連 116034;2.國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心,遼寧 大連 116034)

        刺參(棘皮動(dòng)物門(mén),海參綱)與人參、燕窩、魚(yú)翅齊名,是中國(guó)海產(chǎn)珍品之一。據(jù)統(tǒng)計(jì),2016年,我國(guó)的養(yǎng)殖產(chǎn)量為20萬(wàn) t,主產(chǎn)區(qū)在山東和遼寧[1]。與常見(jiàn)的經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)品相比,刺參具有較強(qiáng)的自溶能力,受紫外線、機(jī)械摩擦等外界刺激極易發(fā)生自溶。在刺參的貯藏、運(yùn)輸和加工過(guò)程中,經(jīng)常因自溶導(dǎo)致刺參原料品質(zhì)下降而造成經(jīng)濟(jì)損失。相關(guān)研究表明,刺參自溶的根本原因是其組織內(nèi)源性蛋白酶,半胱氨酸蛋白酶[2-3]、天冬氨酸蛋白酶[4]及基質(zhì)金屬蛋白酶[5-6]均可促進(jìn)捕撈后刺參的自溶。

        絲氨酸蛋白酶是活性中心含有絲氨酸作為親核氨基酸的一大類蛋白酶的總稱,廣泛分布于真核和原核動(dòng)物體內(nèi)[7]。根據(jù)底物特異性,絲氨酸蛋白酶可以分為胰蛋白酶樣、胰凝乳蛋白酶樣、凝血酶樣、彈性蛋白酶樣和枯草桿菌蛋白酶樣蛋白酶[8]。其中,胰蛋白酶樣和胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶在自然界中分布最為廣泛,根據(jù)MEROPS數(shù)據(jù)庫(kù)提供的信息,已經(jīng)有超過(guò)240 種[9]。水產(chǎn)動(dòng)物貯運(yùn)及加工過(guò)程中以蛋白質(zhì)降解為典型特征的自溶現(xiàn)象比較普遍,絲氨酸蛋白酶已被發(fā)現(xiàn)參與蝦[10]及魚(yú)肉[11-12]的自溶。在刺參自溶研究方面,Yan Longjie等[13]利用從刺參腸中分離純化得到絲氨酸蛋白酶,發(fā)現(xiàn)該酶能夠降解從刺參體壁中提取的膠原蛋白。李傲婷等[14]利用蛋白酶特異性抑制劑發(fā)現(xiàn)絲氨酸蛋白酶參與刺參腸的自溶。Liu Ziqiang等[15]發(fā)現(xiàn)外源胰蛋白酶能夠部分降解刺參膠原從而推測(cè)絲氨酸蛋白酶可能參與刺參自溶。至今,尚鮮有關(guān)于刺參體壁中內(nèi)源性絲氨酸蛋白酶的一般酶學(xué)性質(zhì)及對(duì)刺參體壁自溶影響的報(bào)道。因此,本研究從刺參體壁中提取粗酶液,利用特異性熒光底物對(duì)胰/類胰絲氨酸蛋白酶的基本酶學(xué)性質(zhì)及其在刺參自溶中的潛在作用進(jìn)行研究,為闡明刺參自溶機(jī)制提供理論支持。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        新鮮刺參,購(gòu)自大連市劉家橋市場(chǎng)“長(zhǎng)??h刺參專賣店”。

        Boc-Phe-Ser-Arg-MCA、Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-MCA、Suc-Ala-Pro-Ala-MCA、Suc-Ala-Ala-Ala-MCA日本Peptide Institute有限公司;蛋白酶抑制劑(Aprotinin)、鄰菲咯啉、(3S)-7-氨基-1-氯-3-磺酰氨基-2-庚酮鹽酸鹽((3S)-1-chloro-3-tosylamido-7-amino-2-heptanone hydrochloride,TLCK)、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)、Na-對(duì)甲苯磺酰-L-苯丙氨酸氯甲基酮((S)-1-chloro-3-tosylamido-4-phenyl-2-butanone,TPCK)、碘乙酸、乙二胺四乙酸、抗蛋白酶(Antipain)、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟鹽酸鹽(4-(2-aminoethyl)benzenesulfonylflu oridehydrochlorid,AEBSF)、大豆胰蛋白酶抑制劑(soybean trypsin inhibitor,SBTI)、抑肽素(Pepstatin)生化試劑 美國(guó)Sigma化學(xué)藥品公司;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO) 生工生物工程(上海)股份有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        L-550臺(tái)式低速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司;F-2700熒光分光光度計(jì) 日本Hitachi公司;RC-6+冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司;T27127分光光度計(jì) 北京普析通用責(zé)任有限公司;M200酶標(biāo)儀瑞士Tecan Infinite公司;JJ200Y精密電子天平 美國(guó)雙杰兄弟(集團(tuán))有限公司;PB-10 pH計(jì) 德國(guó)Sartorius公司。

        1.3 方法

        1.3.1 刺身體壁粗酶液的制備

        鮮活刺參去頭去腸去體腔液后,用去離子水洗凈附著的泥沙等異物。將體壁切碎,稱取100 g加入Tris-HCl緩沖液(1∶1(g/mL),50 mmol/L,pH 7.5),于冰浴中進(jìn)行勻漿(用3~5 s從2 000 r/min升到8 000 r/min,維持6~8 s然后降至2 000 r/min,如此反復(fù)3~5 次),在4 ℃層析柜內(nèi)攪拌浸提1 h,然后13 500 r/min冷凍離心15 min,并收集上清液。加硫酸銨至40%,經(jīng)13 500 r/min冷凍離心15 min后,取上清液,再加硫酸銨至80%,經(jīng)13 500 r/min冷凍離心15 min后,收集沉淀。用緩沖液溶解沉淀,之后用相應(yīng)的緩沖液透析24 h(透析袋截留分子質(zhì)量為10 kDa),收集透析液。最后用10 kDa的超濾膜進(jìn)行超濾,以去除小分子蛋白,并對(duì)粗酶液進(jìn)行濃縮,收集未透過(guò)部分放入-80 ℃待用。

        1.3.2 底物特異性測(cè)定

        取150 μL的刺參絲氨酸蛋白酶粗酶液,加入75 μL Tris-HCl緩沖液,振蕩混勻,在46 ℃孵育2 min,再分別加入75 μL以下4 種底物:Boc-Phe-Ser-Arg-MCA、Suc-Ala-Pro-Phe-MCA、Suc-Ala-Pro-Ala-MCA、Suc-Ala-Ala-Ala-MCA,同1.3.3節(jié)條件孵育30 min,然后加入300 μL終止液,并檢測(cè)酶活力。

        1.3.3 絲氨酸蛋白酶活力測(cè)定

        按照Guo Chuan等[16]的方法,稍作修改進(jìn)行測(cè)定。將絲氨酸蛋白酶底物Boc-Phe-Ser-Arg-MCA溶于DMSO配成1 mol/L貯存液,分裝后于-20 ℃冰箱中備用,使用時(shí)用純凈水稀釋至100 mmol/L。將75 μL酶液、150 μL的Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L,pH 7.5)混勻,46 ℃預(yù)熱2 min,再加入75 μL底物混勻,46 ℃孵育30 min,加入300 μL終止液(甲醇-異丙醇-水(35∶35∶30,V/V))混勻。用熒光光度計(jì)激發(fā)波長(zhǎng)380 nm、發(fā)射波長(zhǎng)460 nm測(cè)OD值,以等量的緩沖液代替酶液作對(duì)照。在此條件下,以每小時(shí)催化底物釋放l μmol MCA的酶量定義為1 個(gè)活力單位U。

        1.3.4 最適pH值、溫度及熱穩(wěn)定性的測(cè)定

        使用0.05 mol/L不同pH值緩沖溶液(HAc-NaAc緩沖液pH 4.0~6.0,Tris-HCl緩沖液pH 7.0~9.0,NaHCO3-NaOH緩沖液pH 10.0)測(cè)定刺參絲氨酸蛋白酶的最適pH值。取150 μL的刺參絲氨酸蛋白酶粗酶液,分別加入上述不同pH值緩沖液,在46 ℃將上述pH值溶液和底物反應(yīng)30 min并測(cè)定酶活性。使用最適pH值緩沖液,將提取的蛋白酶在25~80 ℃的范圍內(nèi)進(jìn)行最適溫度的測(cè)定。為確定其熱穩(wěn)定性,將提取的蛋白酶在25~80 ℃孵育30 min后檢測(cè)酶活力[4]。

        1.3.5 金屬離子對(duì)絲氨酸蛋白酶的影響

        取75 μL的刺參絲氨酸蛋白酶,分別加入75 μL以下金屬離子:Cu2+、Pb2+、Fe2+、Mn2+、Ba2+、Fe3+、Cr3+、Zn2+、Mg2+,在最適溫度下孵育30 min后加入150 μL緩沖液,在最適溫度下孵育2 min,加入特異性底物75 μL反應(yīng)30 min后加終止液300 μL混勻,取出后檢測(cè)酶活力[17]。

        1.3.6 抑制劑對(duì)絲氨酸蛋白酶的影響

        取75 μL的刺參絲氨酸蛋白酶粗酶液,分別加入75 μL抑制劑TPCK、TLCK、PMSF、碘乙酸、Antipain、乙二胺四乙酸、二硫蘇糖醇、鄰菲咯啉、Aprotinin、AEBSF,在最適溫度下孵育30 min后加入150 μL緩沖液,孵育2 min,加入特異性底物75 μL反應(yīng)30 min后加終止液300 μL混勻,并檢測(cè)酶活力[17]。

        1.3.7 絲氨酸蛋白酶對(duì)刺參自溶的影響

        稱取一定量的刺參(100±10)g剁碎,然后在冰浴中用勻漿機(jī)勻漿(8 000 r/min,10 s,3~5 次)。稱?。?.5±0.002)g刺參勻漿物于10 mL EP管中。用50 mmol/L pH 7.5的Tris-HCl緩沖液將絲氨酸蛋白酶的特異性抑制劑(PMSF、TPCK、TLCK、AEBSF、SBTI)稀釋到需要的終濃度的2 倍,然后按照質(zhì)量與抑制劑體積比為1∶1(g/mL)添加,立即振蕩混勻。用Tris-HCl緩沖液代替抑制劑作為對(duì)照組。最后于46 ℃孵育0、2、4、5、6 h,誘導(dǎo)自溶。對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)將EP管取出放入冰水浴中終止反應(yīng),13 500×g、4 ℃離心15 min,取上清液備用。采用福林-酚法測(cè)定上清液中可溶性蛋白含量[18]。取上清液,按照體積比1∶2添加10% TCA,混勻并反應(yīng)20 min后,10 000×g、4 ℃離心15 min,取上清液,采用福林-酚法檢測(cè)可溶性寡肽的含量。取上清液,按照1.3.2節(jié)方法測(cè)定絲氨酸蛋白酶活力的變化。

        1.4 數(shù)據(jù)處理

        采用Origin 8.0繪制曲線;采用SPSS 19進(jìn)行差異顯著性分析,P<0.05,差異顯著。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 底物特異性

        圖1 刺參體壁絲氨酸蛋白酶底物特異性Fig. 1 Substrate specificity of serine protease in dermis of S. japonicus

        利用4 種絲氨酸蛋白酶的熒光底物Boc-Phe-Ser-Arg-MCA(胰/類胰蛋白酶底物)、Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-MCA(胰凝乳蛋白酶)、Suc-Ala-Pro-Ala-MCA(彈性蛋白酶)、Suc-Ala-Ala-Ala-MCA(彈性蛋白酶)測(cè)定刺參體壁絲氨酸蛋白酶的活性,結(jié)果見(jiàn)圖1。其中,用Boc-Phe-Ser-Arg-MCA測(cè)得的酶活力遠(yuǎn)高于其他3 種底物,表明刺參絲氨酸蛋白酶識(shí)別和水解該底物的特異性最高而且刺參體壁中胰/類胰蛋白酶的活性較高。蛋白酶對(duì)不同底物的識(shí)別特異性的確存在較大差異。刺參腸道蛋白酶對(duì)血紅蛋白、酪蛋白和BApNA這3 種底物的水解能力存在很大差異,對(duì)酪蛋白的水解活性最強(qiáng),而對(duì)常用的絲氨酸蛋白酶底物BApNA的水解最弱[19]。Osatomi[20]和Guo Chuan[16]等均發(fā)現(xiàn)鯉魚(yú)和鯽魚(yú)肌肉中絲氨酸蛋白酶對(duì)熒光底物中Phe-Ser-Arg、Gln-Arg-Arg、Val-Pro-Arg這三聯(lián)氨基酸殘基的催化活性最強(qiáng)。由此可見(jiàn),刺參絲氨酸蛋白酶中的胰/類胰蛋白酶與鯽魚(yú)和鯉魚(yú)胰/類胰蛋白酶的底物特異性有相似之處。在后續(xù)的酶活檢測(cè)中均選取Boc-Phe-Ser-Arg-MCA作為最適底物。

        2.2 最適pH值、溫度及熱穩(wěn)定性分析

        圖2 刺參絲氨酸蛋白酶的最適pH值分析Fig. 2 Optimal pH of sea cucumber serine protease

        由圖2可見(jiàn),對(duì)于刺參體壁中絲氨酸蛋白酶,在pH 6.2、8.5出現(xiàn)2 個(gè)酶活力峰表明刺參體壁中至少含有2 種胰/類胰蛋白酶。Yan Longjie等[13]刺身腸道中分離出一種類型為subtilisin/kexin的絲氨酸蛋白酶,該酶的最適pH值為7.0,pH值低于5或高于9時(shí)酶活性幾乎消失。Fu Xueyan等[19]發(fā)現(xiàn)在pH 8、13.5出現(xiàn)酶活力峰的兩種刺參腸道蛋白酶為絲氨酸蛋白酶。由此可推測(cè),刺參體壁絲氨酸蛋白酶的類型及性質(zhì)與腸道絲氨酸蛋白酶有較大差異。

        圖3 刺參絲氨酸蛋白酶的最適溫度分析Fig. 3 Optimal temperature of sea cucumber serine protease

        圖4 刺參絲氨酸蛋白酶的熱穩(wěn)定性分析Fig. 4 Temperature stability of sea cucumber serine protease

        由圖3可見(jiàn),溫度在45~55 ℃時(shí)酶活力均處于較高水平,50~55 ℃時(shí)酶活力出現(xiàn)峰值,由于酶活力峰較寬,提示兩種胰/類胰蛋白酶的最適溫度敏感性比較相似。當(dāng)溫度高于55 ℃時(shí),酶活力迅速大幅度下降,提示55 ℃是刺參胰胰/類胰蛋白酶最大活力和失活的臨界點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室系列研究顯示刺身體壁和腸道的半胱氨酸蛋白酶的最大酶活力溫度也均在50~55 ℃[17,21-22]。盡管蛋白酶類型不同,但海參體壁及腸道蛋白酶卻有相似的最適溫度。研究發(fā)現(xiàn),歐洲鯽魚(yú)肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶的最適溫度為55 ℃[16],日本鱸魚(yú)肝胰腺組織中的胰凝乳蛋白酶的最適溫度為45 ℃[23],鰹魚(yú)內(nèi)臟胰蛋白酶的最適溫度為60 ℃[24],真鯛肌肉中絲氨酸蛋白酶的最適溫度為40 ℃[25],由此,水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物體內(nèi)蛋白酶最適溫度很可能與物種本身關(guān)系最為密切。

        圖4顯示,刺參體壁中胰/類胰蛋白酶在30~50 ℃范圍內(nèi)活力穩(wěn)定且有一定提高,提示該類蛋白酶具有一定的熱激活特性。但與圖3對(duì)應(yīng),當(dāng)溫度超過(guò)50 ℃時(shí)其酶活力急劇下降,超過(guò)60 ℃其酶活力基本喪失,這一結(jié)果也與刺參半胱氨酸蛋白酶的溫度穩(wěn)定性幾乎相同[17,21-22]。

        2.3 金屬離子對(duì)絲氨酸蛋白酶活力的影響

        圖5 金屬離子對(duì)刺參絲氨酸蛋白酶活性的影響Fig. 5 Effect of metal ions on the activity of sea cucumber serine protease

        從圖5可以看出,只有Ca2+能夠促進(jìn)該酶活力;Fe2+、Mn2+、Cr3+、Mg2+對(duì)刺參體壁絲氨酸蛋白酶有一定的抑制作用,抑制作用在14.2%~37.1%之間;Cu2+、Fe3+、Pb2+、Zn2+則能強(qiáng)烈抑制該酶的活性,抑制率均在73%以上,其中Cu2+幾乎完全抑制該酶活性。王夢(mèng)想等[26]也報(bào)道Cu2+對(duì)藍(lán)圓鲹絲氨酸蛋白酶有顯著抑制作用,F(xiàn)e2+、Mn2+有較明顯的抑制作用。Costa等[27]也報(bào)道了終濃度為1 mmol/L的Zn2+、Cu2+、Pb2+對(duì)黃尾鲹絲氨酸蛋白酶活力有明顯抑制作用。Grover等[28]報(bào)道Cu2+以非競(jìng)爭(zhēng)性抑制而Zn2+則以反競(jìng)爭(zhēng)性抑制的方式抑制類胰蛋白酶的活性。金屬離子通過(guò)與蛋白酶活性域或底物識(shí)別/結(jié)合位點(diǎn)中某些氨基酸的結(jié)合,使催化位點(diǎn)或更為穩(wěn)定或更不穩(wěn)定,實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白酶活力的促進(jìn)或抑制作用[7]。

        2.4 抑制劑對(duì)絲氨酸蛋白酶活性的影響

        圖6顯示,與對(duì)照組比較,絲氨酸蛋白酶特異性抑制劑TLCK、PMSF、TPCK、AEBSF和SBTI以及半胱氨酸/絲氨酸蛋白酶抑制劑Antipain均能夠明顯抑制該酶活力。Aprotinin為一種來(lái)自牛肺的胰蛋白酶抑制劑,對(duì)該酶的抑制作用較弱,提示海參胰/類胰蛋白酶與牛胰蛋白酶在結(jié)構(gòu)上有較大差異。鄰菲咯啉和乙二胺四乙酸對(duì)該酶的抑制作用分別為47%和20%,提示該酶具有一定的離子依賴性。作為半胱氨酸的修飾劑,碘乙酸體現(xiàn)出強(qiáng)烈的酶活抑制作用,提示半胱氨酸對(duì)刺參胰/類胰蛋白酶活性中心或底物識(shí)別/結(jié)合部位的空間結(jié)構(gòu)有較大影響。

        圖6 蛋白酶抑制劑對(duì)刺參絲氨酸蛋白酶的影響Fig. 6 Effect of protease inhibitors on the activity of sea cucumber serine protease

        2.5 自溶過(guò)程中可溶性蛋白的變化

        圖7 絲氨酸蛋白酶抑制劑對(duì)刺參自溶5 h后可溶蛋白含量的影響Fig. 7 Effect of serine protease inhibitors on soluble protein content in sea cucumber after 5 h autolysis

        實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),海參自溶過(guò)程中可溶性蛋白的降解早于其他類型蛋白的改變[2]。由圖7可知,5 種抑制劑均可抑制自溶過(guò)程中總可溶性蛋白的生成。其中,以PMSF、SBTI、TPCK的抑制作用最為顯著,終濃度為0.1 mol/L即可達(dá)到最大抑制作用。AEBSF和TLCK的抑制作用相對(duì)小一些,但有良好的量效關(guān)系。雖然5 種抑制劑對(duì)刺參胰/類胰蛋白酶的抑制作用機(jī)制不同,但對(duì)可溶性蛋白生成量的抑制提示絲氨酸蛋白酶很可能參與了刺參體壁的自溶(蛋白降解)過(guò)程。李傲婷等[14]研究了內(nèi)源酶對(duì)刺參腸自溶的影響,結(jié)果表明,Pepstatin、SBTI、TLCK、TPCK等均對(duì)刺參腸的自溶也有一定抑制作用,同時(shí)絲氨酸蛋白酶參與了海參自溶過(guò)程。

        2.6 自溶過(guò)程中TCA可溶性寡肽的變化

        如圖8所示,5 種絲氨酸蛋白酶特異性抑制劑均可在一定程度上抑制自溶過(guò)程中TCA可溶性寡肽的生成,其中終濃度為1 mmol/L AEBSF的抑制作用最為顯著。與圖7比較,絲氨酸蛋白酶抑制劑對(duì)TCA寡肽生成的抑制作用不如對(duì)可溶性蛋白生成的抑制作用強(qiáng)。這提示絲氨酸蛋白酶很可能主要參與自溶初期大分子蛋白的解離或斷裂;而TCA寡肽的生成,除絲氨酸蛋白酶的作用外,還有其他類型蛋白酶或端肽參與。鄭杰等[29]也發(fā)現(xiàn)海參自溶過(guò)程中TCA可溶性寡肽含量有明顯上升。

        圖8 絲氨酸蛋白酶抑制劑對(duì)刺參自溶5 h后TCA可溶性寡肽含量的影響Fig. 8 Effect of serine protease inhibitors on TCA soluble oligopeptide content in sea cucumber after 5 h autolysis

        2.7 自溶過(guò)程中絲氨酸蛋白酶活力的變化

        圖9 絲氨酸蛋白酶抑制劑對(duì)刺參自溶5 h絲氨酸蛋白酶活力變化的影響Fig. 9 Effect of serine protease inhibitors on serine protease activity in sea cucumber after 5 h autolysis

        圖9 顯示刺參體壁自溶5 h后絲氨酸蛋白酶活力及抑制劑對(duì)酶活力的影響。AEBSF的抑制作用最為明顯,其次是SBTI,量效關(guān)系最為顯著。AEBSF和SBTI均為胰/類胰蛋白酶抑制劑,與前面底物特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)應(yīng),而且進(jìn)一步提示刺參體壁中的胰/類胰蛋白酶是參與刺參自溶的主要絲氨酸蛋白酶類型。

        3 結(jié) 論

        刺參體壁中至少存在2 種胰/類胰絲氨酸蛋白酶的活力較高,分別在pH 6.2和pH 8.5呈現(xiàn)較高活力,其最適溫度范圍均為50~55 ℃,在50 ℃以下具有一定穩(wěn)定性;Cu2+、Fe3+、Pb2+、Zn2+則能強(qiáng)烈抑制該酶的活性,Ca2+可促進(jìn)該酶活力;PMSF、TPCK、TLCK、AEBSF、SBTI 5 種絲氨酸蛋白酶特異性抑制劑均可抑制該酶活力,并可降低自溶過(guò)程中可溶性蛋白和TCA可溶性寡肽的生成,說(shuō)明該類絲氨酸蛋白酶很有可能參與海參自溶過(guò)程。

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