何玉蘭，王 斌,2，潘 力,2,*

（1.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006；2.廣東省發(fā)酵與酶工程重點實驗室，廣東 廣州 510006）

果膠酶是指降解果膠質的一類酶的總稱，根據其作用機理可分為3 大類：聚半乳糖醛酸酶（E.C.3.2.1.2）、果膠甲酯酶（E.C.3.1.11.1）、果膠裂解酶（E.C.4.2.2.10）[1-3]。果膠裂解酶可直接作用于高度甲酯化果膠，不需要果膠甲酯酶的預先作用，從而避免了甲醇的生成[4]。酸性果膠裂解酶在果蔬汁加工行業(yè)中應用十分廣泛，原因在于其最適反應pH值與大多數果汁天然pH值接近，都為酸性[5-6]。目前文獻報道研究較多為最適反應pH值為堿性或中性的果膠裂解酶，其在酸性條件下極不穩(wěn)定[7-10]，而對酸性果膠裂解酶的研究主要集中在發(fā)酵過程優(yōu)化和重組表達等方面[11-14]，謝茂芳等[15]實現了黑曲霉果膠裂解酶在大腸桿菌的異源表達，由于形成包涵體未能檢測到酸性果膠裂解酶活力；強慧妮等[16]將黑曲霉果膠裂解酶基因在畢氏酵母中進行表達，得到酸性果膠酶裂解酶活力僅為2.3 U/mL；此外，Kitamoto等[17]報道的酸性果膠裂解酶活力較高為4 060.0 U/mL。但總體說來，目前酸性果膠裂解酶表達水平不高，在較大程度上限制了其工業(yè)應用。

曲霉表達系統(tǒng)具有蛋白分泌量高、成本低、可進行蛋白翻譯后修飾等優(yōu)點，黑曲霉作為典型的絲狀真菌，被廣泛地用于重組蛋白的表達[18-20]。此外，黑曲霉作為Generally recognized as safe（GRAS）微生物被廣泛用作食品行業(yè)酶制劑的生產菌株。本研究使用黑曲霉自身強啟動子（PglaA）實現酸性果膠裂解酶基因pelD的過量表達，通過融合6×His標簽實現重組果膠裂解酶的純化，研究了重組果膠裂解酶的酶學性質，并測定了其對3 種不同果汁（橙汁、蘋果汁和葡萄汁）的澄清效果，以期為酸性果膠裂解酶的工業(yè)化應用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質粒

大腸桿菌Match 1T1感受態(tài)購自美國Invitrogen公司，黑曲霉（Aspergillus niger）菌株SH-2[21]、表達載體pMD18-TP均由本實驗室構建并保藏。

1.1.2 試劑

聚半乳糖醛酸鈉鹽、蘋果果膠（50%～75%酯化度）、柑橘果膠（≥85%酯化度） 美國Sigma-Aldrich公司；限制性內切酶、DNA聚合酶 日本TaKaRa公司；其他試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：2%葡萄糖，1%蛋白胨，1%酵母膏；察氏培養(yǎng)基（Czapek-Dox，CD）培養(yǎng)基：2%葡萄糖，0.3% NaNO3，0.2% KCl，0.05%MgSO4·7H2O，0.1% KH2PO4，0.001% FeSO4·7H2O，2%瓊脂粉，pH 5.5；發(fā)酵培養(yǎng)基：5%玉米淀粉，3%玉米漿，2%豆粕粉。

1.2 儀器與設備

多功能酶標儀 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 重組表達質粒的構建

以黑曲霉C B S 5 1 3.8 8 基因組為模板，使用特異性引物使用特異性引物（p 1：5’-ATGAAGTACGCTGCTGGCTCTC-3’；p2：5’-tagcg aaatggattgattgtTTAGTGATGATGATGATGATGCAGGT TACCCTGACAGCG-3’）擴增得到果膠裂解酶基因pelD（GenBank：M55657.1）。將目的基因pelD連接到表達載體pMD18-TP，得到重組表達質粒pMD18-pelD，并轉化大腸桿菌。陽性轉化子經抗性篩選及Apa I酶切驗證，并經測序驗證。

1.3.2 黑曲霉轉化及發(fā)酵培養(yǎng)

將宿主菌黑曲霉SH-2接種至YPD培養(yǎng)基，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)72 h。利用Apa I酶切線性化重組表達質粒pMD18-pelD，采用原生質體轉化法將其轉化宿主菌[22]。轉化子在CD培養(yǎng)基上培養(yǎng)72 h，溫度30 ℃。提取基因組進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）鑒定及測序，將陽性轉化子接種于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)144 h，每隔24 h取樣，測定酶活力。

1.3.3 酸性果膠裂解酶活力測定

參照Albersheim[23]方法進行并作適當調整。用濃度為1/15 mol/L KH2PO4-Na2HPO4（pH 5.2）緩沖液配制0.5 g/100 mL蘋果果膠。取500 μL底物預熱至40 ℃，加入250 μL適當稀釋的粗酶液，40 ℃反應10 min（pH 5.2），加入800 μL 0.02 mol/L H3PO4溶液終止反應，235 nm波長處測定其吸光度。1 個標準酶活力單位定義為：在測定條件下，每分鐘使235 nm波長處吸光度增加0.01所需的酶量。

1.3.4 重組酸性果膠裂解酶純化

由于重組酸性果膠裂解酶帶有6×His標簽，故采用鎳柱親和層析純化重組蛋白，重組菌株經搖瓶培養(yǎng)144 h后，收集上清液用于純化。使用的層析柱為HisTrapTMHP，上樣量為30 mL，采用梯度洗脫法（咪唑濃度0～0.5 mol/L），流速2.0 mL/min。對收集到純化樣品進行酶活力測定，采用BCA蛋白濃度測定方法測定蛋白含量，以牛血清白蛋白作為標準蛋白。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測純化效果并進行Western blot鑒定。

1.3.5 Western blot鑒定表達產物

對純化后重組蛋白進行SDS-PAGE分析。SDS-PAGE結束后，將凝膠中的蛋白電轉印跡至硝酸纖維素膜上，封閉液室溫封閉1 h；Western雜交膜清洗液洗3 次，每次5 min；用His-Tag抗體作為一抗（稀釋比例為1∶1 000）室溫孵育2 h；Western雜交膜清洗液洗3 次，用辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG作為二抗（稀釋比例為1∶1 000）室溫孵育1 h；Western雜交膜清洗液洗3 次后，用超敏ECL化學發(fā)光試劑盒檢測免疫反應條帶。

1.3.6 重組酸性果膠裂解酶酶學特性分析

為研究重組酶的底物特異性，在標準條件下，分別測定其對3 種不同酯化程度底物（聚半乳糖醛酸鈉鹽（酯化度為0%）、蘋果果膠（酯化度50%～75%）、柑橘果膠（酯化度≥85%））的酶活力，其中底物質量濃度均為0.5 g/100 mL。

最適溫度和pH值測定：在pH 5.2條件下，測定不同溫度（20、30、40、50、60、70、80 ℃）條件下的酶活力；在測得的最適反應溫度條件下，測定不同pH值（3.0～8.0）條件下的酶活力，其中底物用相應pH值的緩沖液溶解；以最大活力為100%。

溫度和pH值穩(wěn)定性測定：將酶液于不同溫度（30～70 ℃）處理2 h，在標準條件下測定剩余酶活力，以未經處理組的酶活力為100%；將酶液置于不同pH值（3.0～7.0）磷酸鹽-檸檬酸緩沖液中，40 ℃處理2 h后測定剩余酶活力；以未經處理組的酶活力為100%。

金屬離子及表面活性劑SDS對酸性果膠裂解酶活力的影響：在標準測定體系中分別加入不同金屬離子及表面活性劑SDS使其終濃度為1 mmol/L，測定酶活力，以未經處理組的酶活力為100%。

1.3.7 重組酸性果膠裂解酶在果汁澄清中的應用

將橙子（新奇士）、蘋果（富士）和葡萄（巨峰）用榨汁機制成果汁，蘋果汁需加0.2 g/100 mL抗壞血酸，3 種果汁的pH值分別為：橙汁3.76、蘋果汁4.0、葡萄汁4.03。將不同量的重組酸性果膠裂解酶（0、1、2、5、10、25、50 U）分別加入至1 mL果汁中，37 ℃保溫45 min后，2 000×g離心3 min，取上清測定在660 nm波長處的透光度（%），以滅活的酶液作為對照組。

2 結果與分析

2.1 酸性果膠裂解酶基因克隆及序列分析

以黑曲霉CBS513.88菌株基因組DNA為模板，PCR擴增得到酸性果膠裂解酶基因（pelD）序列。酸性果膠裂解酶基因pelD全長為1 369 bp，編碼373 個氨基酸，經SignalP4.1在線預測分析，表明該蛋白具有N-端信號肽，信號肽切割位點在第19～20個氨基酸之間。

2.2 重組酸性果膠裂解酶的表達

圖1 重組表達質粒pMD18-pelD的構建Fig. 1 Schematic illustration of pMD18-pelD construction

圖2 重組菌發(fā)酵上清液酶活力測定（A）及SDS-PAGE分析（B）Fig. 2 Enzymatic activity (A) and SDS-PAGE analysis (B) of the culture supernatant of the recombinant strain at different culture times

將pelD基因用infusion酶連接到表達載體，獲得重組表達質粒pMD18-pelD，重組表達質粒示意圖如圖1所示，使用黑曲霉自身強啟動子（葡萄糖淀粉酶啟動子PglaA）實現酸性果膠裂解酶基因pelD的過量表達。將重組表達質粒pMD18-pelD轉化宿主黑曲霉SH-2，獲得重組工程菌SH2-PelD。將重組工程菌SH2-PelD接種至發(fā)酵培養(yǎng)基進行搖瓶發(fā)酵，每24 h離心取上清液測定酸性果膠裂解酶活力，結果如圖2A所示。酸性果膠裂解酶活力隨培養(yǎng)時間的延長而增加，在120 h時達到最高（8 822.6 U/mL）。同時，作為陰性對照的宿主菌未檢測到酸性果膠裂解酶活力。此外，對發(fā)酵上清液進行SDS-PAGE檢測（圖2B），結果表明在大約40 kDa的位置出現一條明顯的電泳條帶，與預測的理論分子質量大?。?9.0 kDa）一致，說明重組酸性果膠裂解酶在黑曲霉SH-2中成功實現了過量表達。

2.3 重組酸性果膠裂解酶的純化

圖3 純化后重組酸性果膠裂解酶的SDS-PAGE分析（A）及Western blot鑒定（B）Fig. 3 SDS-PAGE analysis (A) and Western blot (B) of purified rePelD

為更好地研究重組酸性果膠裂解酶的性質，對帶有組氨酸標簽的重組蛋白進行鎳柱親和層析純化。經一步純化后得到了單一條帶（圖3A）。經鎳柱一步純化后，重組酸性果膠裂解酶純化倍數為4.9 倍，回收率為79.4%，比活力達到8 522.7 U/mg（表1）。此外，通過Western blot進一步驗證了重組蛋白（圖3B）。

表1 純化發(fā)酵液上清中的重組酸性果膠裂解酶Table 1 Purification of rePelD from the culture supernatant

2.4 重組酸性果膠裂解酶酶學性質分析

2.4.1 重組酸性果膠裂解酶的底物特異性

分別以0.5 g/100 mL聚半乳糖醛酸鈉鹽（酯化度為0%）、蘋果果膠（酯化度50%～75%）、柑橘果膠（酯化度≥85%）為底物，測定重組酶活力，以底物為柑橘果膠的酶活力為100%，計算其他底物的相對酶活力。如表2所示，重組酸性果膠裂解酶對柑橘果膠的酶活力最高為31 248.0 U/mL，其次為蘋果果膠（11 164.1 U/mL），而對聚半乳糖醛酸鈉鹽僅有微弱的酶活力。表明重組酸性果膠裂解酶能夠特異性降解高酯化程度的果膠。

表2 重組酸性果膠裂解酶的底物特異性Table 2 Substrate specificity of rePelD

2.4.2 最適反應pH值及pH值穩(wěn)定性

將重組酸性果膠裂解酶置于不同pH值（3.0～7.0）緩沖液中測定酶活力，結果表明該重組酶最適反應pH值為5.0，當pH值大于7時，酶活力基本為0（圖4A）。將重組酸性果膠裂解酶置于不同pH值（3.0～7.0）緩沖液中，40 ℃保溫2 h后測定殘余酶活力，結果表明該重組酶在酸性條件下穩(wěn)定性良好，在pH 3.0～6.5范圍內能保持50%以上的相對酶活力（圖4B）。

圖4 重組酸性果膠裂解酶最適反應pH值（A）和pH值穩(wěn)定性（B）Fig. 4 Effect of pH on the activity (A) and stability (B) of rePelD

2.4.3 最適反應溫度及熱穩(wěn)定性

將重組酶置于不同溫度（20～80 ℃）下測定酶活力，結果表明該重組酶的最適反應溫度為50 ℃（圖5A）。將重組酸性果膠裂解酶置于不同溫度（30～70 ℃）保溫2 h后測定殘余酶活力，結果表明該重組酶在30～50 ℃范圍內穩(wěn)定性較好，能保持80%以上的相對酶活力（圖5B）。

圖5 重組酸性果膠裂解酶最適反應溫度（A）和熱穩(wěn)定性（B）Fig. 5 Effect of temperature on the activity (A) and stability (B) of rePelD

2.4.4 金屬離子及化學試劑對重組酶的影響

表3 金屬離子和化學試劑對重組酸性果膠裂解酶活力的影響Table 3 Effects of metal ions and chemical reagents on the activity of rePelD

表3表明，在1 mmol/L濃度下，Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Ni2+、Mn2+、Ba2+對該重組酶具有不同程度的激活作用，其中Zn2+、Ni2+、Ba2+激活作用較為顯著；而表明活性劑SDS對重組酶有明顯的抑制作用，其他金屬離子對重組酶活力無明顯影響。

2.5 重組酸性果膠裂解酶在果汁澄清中的應用

圖6表明，經重組酸性果膠裂解酶處理后，橙汁、蘋果汁以及葡萄汁在660 nm波長處的透光度顯著高于對照組，說明重組酸性果膠裂解酶對3 種果汁有顯著的澄清效果。其中橙汁的透光度從1.7%增加到30.5%，提高了16.9 倍；而蘋果汁的透光度從6.7%增加至77.0%，提高了10.5 倍；葡萄汁的透光度從13.9%增加至79.2%，提高了4.7 倍。此外，使橙汁、蘋果汁以及葡萄汁達到較好的澄清效果的加酶量分別為10、5、1 U/mL。

圖6 重組酸性果膠裂解酶對3 種果汁（橙汁、蘋果汁和葡萄汁）澄清應用Fig. 6 Clarification of orange, apple and grape juice by using rePelD

3 討 論

黑曲霉作為重組蛋白表達的重要宿主，具有蛋白分泌量大、可進行蛋白翻譯后修飾及高生物安全性等優(yōu)點。本研究利用黑曲霉自身強啟動子PglaA實現了黑曲霉酸性果膠裂解酶基因pelD的過量表達，使得酸性果膠裂解酶活力在搖瓶培養(yǎng)120 h達到8 822.6 U/mL，顯著高于之前文獻報道[16-17,24-25]，為該重組酶的大規(guī)模工業(yè)化生產提供了理論支持。

此外，以黑曲霉為蛋白表達宿主在純化方面存在一定的困難[26-27]，本實驗經一步親和層析得到了高純度目的蛋白，回收率為79.4%，比活力達到8 522.7 U/mg。對重組酶的底物特異性研究表明，重組酸性果膠裂解酶可特異性降解高度甲酯化果膠，這與已有報道一致[24,28]。該重組酶的最適反應溫度為50 ℃，且在30～50 ℃范圍內穩(wěn)定性較好；與來源于米曲霉（最適反應pH 8.5）[29]和黃曲霉（最適反應pH 8.0）[30]果膠裂解酶相比，重組酸性果膠裂解酶的最適反應pH 5.0，接近大多數果汁的天然pH值，且在pH 3.0～6.5的范圍內非常穩(wěn)定；此外，重組酸性果膠裂解酶對橙汁、蘋果汁和葡萄汁均表現出良好的澄清作用，且酶的添加量較少。綜上所述，該重組酶在果蔬汁加工業(yè)中具有較大的應用潛力。