楊 明，伊 鋆，許 晴，董秋花，李首道，陳 丹，王夢穎，管卓龍，何麗姍，盧躍鵬，江小明，涂鳳琴*，宮智勇

（1.武漢食品化妝品檢驗(yàn)所，湖北 武漢 430012；2.武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430030）

我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中登記的農(nóng)藥達(dá)1 000多種。蔬菜種植過程中農(nóng)藥使用不合理、禁限用農(nóng)藥濫用等現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，導(dǎo)致農(nóng)藥殘留問題日益突出，給人們健康帶來極大的危害[1]。因此，農(nóng)藥多殘留的分析監(jiān)測對于指導(dǎo)農(nóng)藥的科學(xué)合理使用，保障食品安全具有重要意義。

目前，蔬菜農(nóng)藥多殘留的分析方法主要有氣相色譜法（gas chromatography，GC）[2-4]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[5-7]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[8-10]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[11-13]等。LC-MS/MS法因其具有選擇性高、靈敏度高、適用范圍廣等特性而被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥多殘留檢測領(lǐng)域。在前處理技術(shù)方面，傳統(tǒng)的前處理方法較為繁瑣復(fù)雜，難以滿足現(xiàn)代分析檢測的要求。QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe）技術(shù)將提取和凈化同步進(jìn)行的最新前處理技術(shù)，吸附劑選擇是QuEChERS技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，針對不同的樣品，QuEChERS方法中不同的吸附劑能夠產(chǎn)生不同的凈化效果，不同的吸附劑組合也會帶來不同的結(jié)果，由于其具有操作簡單、便捷高效、溶劑用量小等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于食品中農(nóng)藥殘留的分析檢測[14-18]。乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、石墨化炭黑（graphitized carbon black，GCB）等是QuEChERS前處理技術(shù)的常用吸附劑，可有效去除基質(zhì)中的有機(jī)酸、糖類和色素等多種組分。GCB具有較好的除色素效果，但對多菌靈、噻菌靈等平面結(jié)構(gòu)農(nóng)藥具有較強(qiáng)的吸附性，因此本實(shí)驗(yàn)不選用該吸附劑。

該研究采用QuEChERS前處理技術(shù)，結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）的高選擇性、高靈敏度和強(qiáng)抗干擾能力等特點(diǎn)[19]，建立了QuEChERS-HPLC-MS/MS快速測定蔬菜中29種農(nóng)藥殘留的分析方法。該方法操作簡便、靈敏度高、重現(xiàn)性好、分析速度快，適用于蔬菜中農(nóng)藥多殘留的同時(shí)檢測，為蔬菜中農(nóng)藥殘留的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測提供了技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

29種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（純度91.5%～99.7%）：Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；甲醇、乙腈、乙酸銨（均為色譜純）：德國Merck公司；甲酸（色譜純）：美國Sigma-Aldrich公司；十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、N-丙基乙二胺（PSA）：上海安譜科學(xué)儀器公司；氯化鈉（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

菠菜、小白菜、黃瓜和韭菜等10種蔬菜樣品從市場上隨機(jī)抽取。

1.2 儀器與設(shè)備

SCIEX4500QTRAP串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有可用于電噴霧電離的TurboV離子源））：美國ABSCIEX公司；LC30A液相色譜儀：日本島津公司；AllegraX-15RCentrifuge離心機(jī)：美國貝克曼庫爾特公司；Vortex-Genie2渦旋振蕩器：美國Scientific Industries公司；PM5-2000TL超聲波清洗器：普律瑪儀器公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)：美國Millipore公司；ME204/02電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取適量的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，配制質(zhì)量濃度為10μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-18℃保存。臨用時(shí)，移取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲備液用空白樣品基質(zhì)提取液配制系列濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2樣品前處理

準(zhǔn)確稱取勻漿的樣品5.0g，置于50mL聚丙烯離心管中，加入10 mL乙睛和3 g NaCl，渦旋混勻，超聲提取30 min，以4750r/min轉(zhuǎn)速離心5min，取上清液待凈化。取2mL上清液置于含有25 mg C18+50 mg PSA吸附劑的離心管中，渦旋30 s，靜置后取上清液過0.22 μm濾膜后，供HPLC-MS/MS測定。

1.3.3 儀器條件

（1）色譜條件

色譜柱：Waters XBridge C18（150 mm×2.1 mm，5 μm）；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：2μL；流動相：A--5mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水；B--5mmol/L乙酸銨-甲醇；梯度洗脫程序：0～1.0min，5.0%B；1.0～3.5 min，5.0%～30.0%B；3.5～6.5 min，30.0%～90.0%B；6.5～9.5 min，90.0%B；9.5～9.6 min，90.0%～5.0%B；9.6～12 min，5.0%B。

（2）質(zhì)譜條件

電離源：電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）正離子模式；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式；電噴霧電壓：4500V；霧化氣：50.0 psi；氣簾氣壓力：30 psi；碰撞氣體：Medium；輔助氣流速：50psi；離子源溫度：450℃。

1.3.4 條件優(yōu)化

（1）色譜條件的優(yōu)化

選擇Waters XBridgeC18色譜柱（150mm×2.1mm，5μm）對29種農(nóng)藥進(jìn)行分離分析，并比較了29種農(nóng)藥在乙腈-水與甲醇-水流動相體系中的色譜分離效果，進(jìn)一步考察不同含量的流動相對分離效果的影響。

（2）質(zhì)譜條件的優(yōu)化

利用針泵進(jìn)樣將29種目標(biāo)化合物注入質(zhì)譜儀中優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)。首先選擇全掃描模式確定29種化合物的母離子。結(jié)果表明29種化合物在正離子（ESI+）掃描模式下的質(zhì)譜響應(yīng)較高。對29種化合物進(jìn)行二級碎片離子掃描，選擇響應(yīng)較高、干擾小的兩個(gè)碎片離子用于定性定量分析，其中響應(yīng)最高的碎片離子用于定量分析。最后優(yōu)化各目標(biāo)化合物的去簇電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)。

（3）提取溶劑的優(yōu)化

該實(shí)驗(yàn)以標(biāo)準(zhǔn)添加樣品對提取溶劑的種類進(jìn)行了考察，比較了甲醇、0.5%甲酸甲醇、1.0%甲酸甲醇、乙腈、0.5%甲酸乙腈、1%甲酸乙腈6種溶劑的提取效果。

（4）凈化方法的選擇

蔬菜基質(zhì)較為復(fù)雜，含色素、有機(jī)酸、維生素、蛋白質(zhì)等多種成分[20]，在提取過程中這些物質(zhì)可能會和目標(biāo)物一起被提取出來，這些共提物不僅干擾目標(biāo)物的檢測，而且可能會損害色譜柱，污染離子源，因此有必要進(jìn)行凈化處理。以菠菜樣品基質(zhì)為例，各凈化方法對回收率的影響。該實(shí)驗(yàn)考察了25mgC18+25mgPSA、50mgC18+25mg PSA、100 mg C18+25 mg PSA、25 mg C18+50 mg PSA、50mgC18+50mgPSA、100mgC18+50mgPSA、25mgC18+100mg PSA、50 mg C18+100 mg PSA、100 mg C18+100 mg PSA這九種不同含量的凈化劑組合對29種農(nóng)藥回收率的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 條件優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 色譜條件優(yōu)化結(jié)果

結(jié)果表明目標(biāo)化合物在5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水和5 mmol/L乙酸銨-甲醇組成的流動相中分離效率高、保留較好且質(zhì)譜響應(yīng)高。因此，該實(shí)驗(yàn)采用5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水和5 mmol/L乙酸銨-甲醇作為流動相。29種農(nóng)藥在MRM模式下的離子色譜圖見圖1。結(jié)果表明，29種目標(biāo)化合物在11 min內(nèi)可實(shí)現(xiàn)良好分離，峰形對稱。

圖1 29種農(nóng)藥在多反應(yīng)監(jiān)測模式下的離子色譜圖Fig.1 Ion chromatographs of 29 pesticides residues with multiple reaction monitoring mode

2.1.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化結(jié)果

29種農(nóng)藥的母離子、子離子、去簇電壓、碰撞能量等重要質(zhì)譜參數(shù)如表1所示，均為29種農(nóng)藥的最佳質(zhì)譜參數(shù)。

表1 29種農(nóng)藥的母離子、子離子等重要質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Precursor ions,products ions,and other important MS parameters of 29 pesticides residues

續(xù)表

2.1.3 提取溶劑的優(yōu)化結(jié)果

不同提取溶劑中29種農(nóng)藥的提取回收率如圖2所示。由圖2可知，6種提取溶劑的平均回收率分別為55.93%、55.30%、56.06%、86.91%、77.98%和77.28%，這表明采用純乙腈的提取效果優(yōu)于其他5種提取試劑，且滿足實(shí)驗(yàn)要求。

圖2 不同提取溶劑對蔬菜中29種農(nóng)藥的提取效率Fig.2 Extraction efficiencies of different extraction solvents for 29 pesticides residues in vegetables

2.1.4 凈化方法的優(yōu)化結(jié)果

不同凈化劑對蔬菜中農(nóng)藥回收率的影響結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，25 mg C18+50 mg PSA凈化效果最佳，對29種農(nóng)藥的平均回收率為90.76%，而其它8種吸附劑對29種農(nóng)藥的平均回收率均低于90%，且在霜霉威的回收率方面，25mg C18+50 mg PSA為72.07%，而50 mg C18+25 mg PSA、50 mg C18+50mgPSA、100mgC18+50mgPSA、25mgC18+100mg PSA、50 mg C18+100 mg PSA、100 mg C18+100 mg PSA均低于70%；啶酰菌胺的回收率方面25 mg C18+50 mg PSA為72.07%，而25 mg C18+25 mg PSA、50 mg C18+25 mg PSA、100 mg C18+25 mg PSA、50 mg C18+50 mg PSA也均低于68%。故選用25 mg C18+50 mg PSA吸附劑組合作為最優(yōu)凈化方案。

圖3 不同凈化劑對蔬菜中29種農(nóng)藥回收率的影響Fig.3 Effect of different purificants on the recoveries of 29 pesticides residues in vegetables

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）指目標(biāo)分析物以外的其他組分對分析信號引起的增強(qiáng)或抑制現(xiàn)象，通常以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值來進(jìn)行評價(jià)。若ME在0.80～1.20之間，基質(zhì)效應(yīng)可以忽略。反之，基質(zhì)效應(yīng)不可忽略[21]。本實(shí)驗(yàn)用菠菜、小白菜黃瓜和韭菜等10種蔬菜的空白基質(zhì)提取液與純?nèi)軇┓謩e配制系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，通過比較標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率來評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明：以菠菜為例，除了氟吡甲禾靈存在一定的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)（ME＞1.20），啶酰菌胺存在一定基質(zhì)抑制效應(yīng)（ME＜0.80）外，其他農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)均在0.80～1.20之間。具體結(jié)果如表2所示。因此，該實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液作校準(zhǔn)曲線來降低基質(zhì)效應(yīng)對測定結(jié)果的影響。

表2 29種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Matrix effect of 29 pesticides

2.3 線性關(guān)系與定量限

用空白基質(zhì)提取液配制系列濃度的29種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明：在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，霜霉威的響應(yīng)值與其質(zhì)量濃度線性關(guān)系較好，相關(guān)系數(shù)（R）為0.995 8，其他28種農(nóng)藥的響應(yīng)值與其質(zhì)量濃度均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R）均大于0.999 0。以10倍信噪比（S/N）計(jì)算定量限（limit of quantitation，LOQ），該方法29種農(nóng)藥的定量限在0.40～8.00 μg/kg之間。選取陰性樣品添加三個(gè)濃度水平（LOQ、4LOQ、20LOQ）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平做6次平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算回收率和精密度，結(jié)果見表3。由表3可知，29種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率在64.62%～123.55%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（rlative sandard deviation，RSD）在0.7%～14.3%之間，表明方法回收率高、精密度高，能夠滿足蔬菜中農(nóng)藥殘留監(jiān)測的要求。

表3 29種農(nóng)藥的線性范圍、線性方程、定量限、加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Linear ranges,linear equations,limits of quantification,recoveries and relative standard deviation of 29 pesticides

2.4 實(shí)際樣品測定

利用該實(shí)驗(yàn)建立的方法對市場上購買的50份蔬菜樣品進(jìn)行檢測，共檢出20份陽性樣品，小白菜、黃瓜、韭菜等樣品中農(nóng)藥殘留的檢出率較高，檢出頻率較高的農(nóng)藥為多菌靈、啶蟲脒、噠螨靈、烯酰嗎啉、辛硫磷等殺菌劑和殺蟲劑。該方法與國標(biāo)方法的部分測定結(jié)果見表4。

表4 部分陽性樣品農(nóng)殘檢測結(jié)果Table 4 Determination results of pesticides residues of practical positive samples

由表4可知，小白菜中的啶蟲脒含量為2.04mg/kg，韭菜中的多菌靈含量為2.25 mg/kg，均超過了GB 2763—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定的最大殘留限量。該實(shí)驗(yàn)同時(shí)采用GB/T 20769—2008《水果和蔬菜中450種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定》標(biāo)準(zhǔn)方法對上述陽性樣品進(jìn)行測定來驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，其結(jié)果與本方法測得值相吻合。

3 結(jié)論

該實(shí)驗(yàn)以蔬菜為研究對象，建立了QuEChERS-HPLCMS/MS快速測定29種農(nóng)藥的分析方法。分別對樣品前處理方法、色譜條件、質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法定量，能夠同時(shí)完成蔬菜中29種農(nóng)藥的定性和定量分析。該方法簡單快速、靈敏可靠，為農(nóng)藥多殘留的測定節(jié)約了分析時(shí)間，可廣泛應(yīng)用于蔬菜中29種農(nóng)藥的測定。