張 潔，張大為*，田永航

（海南熱帶海洋學(xué)院 海南省海洋食品工程技術(shù)研究中心，海南 三亞 572022）

白貝又稱為沙白、海貝，是中國文蛤的一種。身體呈扁圓形，體色一般為白色，殼光亮，廣泛分布于廣東湛江、海南的近海地區(qū)。貝肉肥美、鮮甜，營養(yǎng)價(jià)值非常高，目前以直接食用為主。由于白貝出售過程中極易出現(xiàn)死亡、腐敗的現(xiàn)象，不僅帶來食用安全問題，還是對(duì)原料的極大浪費(fèi)，如果利用這種低價(jià)貝類為原料，進(jìn)行進(jìn)一步加工成附加值高的產(chǎn)品，將會(huì)產(chǎn)生可觀的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益[1-3]。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，人們對(duì)于高水平生活質(zhì)量的要求也越來越迫切，調(diào)味品也是從最初單為滿足口味需求，慢慢發(fā)展為現(xiàn)在對(duì)營養(yǎng)、安全、保健等多方面的追求[4-6]。大量研究表明，開發(fā)多種調(diào)味品是對(duì)傳統(tǒng)調(diào)味品的補(bǔ)充，從而能夠?qū)λa(chǎn)品進(jìn)行深度加工，增加低值原料的附加值，將具有廣闊的應(yīng)用前景[7-15]。天然海鮮調(diào)味料因含有豐富的氨基酸、多肽、核苷酸、有機(jī)酸等多種呈味物質(zhì)及多糖、牛磺酸等具有活性的物質(zhì)，逐漸得到更多消費(fèi)者的青睞[16-19]。白貝發(fā)酵產(chǎn)物含有多種營養(yǎng)物質(zhì)及活性成分（多糖、短肽等），但是在風(fēng)味上也存在醇厚感不足等缺點(diǎn)，因此若想將其加工成天然海鮮調(diào)味品，仍需對(duì)風(fēng)味進(jìn)行進(jìn)一步的改良。

本研究以白貝肉為原料，通過選用適當(dāng)?shù)牡鞍酌杆猓玫揭环N白貝酶解調(diào)味液。通過單因素、正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝條件，并對(duì)調(diào)味液在酶解過程中生化特性進(jìn)行了研究。以期提高低值蛋白質(zhì)的利用率及貝類的附加值又可避免資源浪費(fèi)所造成的環(huán)境污染，促進(jìn)了水產(chǎn)行業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白貝：市售；枯草芽孢桿菌蛋白酶（10萬U/g）：福建緣菱鑫生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（10萬U/g）、風(fēng)味蛋白酶（10萬U/g）：河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

T6型紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器責(zé)任有限公司；HWS-26型超級(jí)恒溫水浴槽、HH型數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司；FA2204B型電子天平：HANGGPING公司；PB-10型酸度計(jì)：德國Sartorius科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 白貝酶解液制備工藝流程及操作要點(diǎn)

白貝→浸泡吐沙→取肉洗凈→白貝肉→打漿→酶解→酶失活→過濾→酶解液

浸泡吐沙：將所用白貝帶殼放置清水中吐沙，放置時(shí)間為5 h左右，而后用清水沖洗。

取肉洗凈：浸泡吐沙后用刀進(jìn)行開殼取肉，并用清水沖洗。打漿：將白貝肉淋干水分后，放在打漿機(jī)中打漿，備用。酶解：將白貝肉漿分別置于酶解容器中，加入定量的蛋白酶，分別在最佳條件下酶解。

滅活：酶解后，將酶解液加熱至100℃，保溫5min，滅活。

過濾：采用無菌紗布，進(jìn)行簡單過濾得到酶解液。

1.3.2 白貝酶解液工藝參數(shù)單因素試驗(yàn)

（1）不同蛋白酶水解效果的比較

在4支10 mL試管中各加入10 g白貝肉漿，分別加入0.16 g/10 g原料枯草芽孢桿菌中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶，以不加蛋白酶作為對(duì)照，在pH7.5、55℃的條件下水解4 h，考察蛋白酶種類對(duì)水解效果的影響。

（2）酶添加順序?qū)λ庑Ч挠绊?/p>

固定酶添加量為0.16 g/10 g原料，兩種酶添加比例為1∶1，在pH值為7.5、55 ℃條件下水解4 h，考察酶添加順序?qū)λ庑Ч挠绊憽?/p>

（3）復(fù)合酶比例對(duì)水解效果的影響

固定酶添加量為0.16g/10g原料，分別設(shè)定枯草芽孢桿菌中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶添加比例為3∶1、2∶1、1∶2、1∶3、1∶4時(shí)，在pH值為7.5、55℃條件下水解4 h，考察兩種酶添加比例對(duì)水解效果的影響。

（4）復(fù)合酶最佳添加量的確定

固定枯草芽孢桿菌中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶=1∶3的比例，在pH值為7.5，55℃條件下水解4 h，分別調(diào)整酶添加量為0.12 g、0.14 g、0.16 g、0.18 g、0.20 g/10 g原料，考察總加酶量對(duì)水解效果的影響。

（5）復(fù)合酶最佳水解時(shí)間的確定

固定復(fù)合酶添加量為0.16 g/10 g原料，枯草芽孢桿菌中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶=1∶3的比例，在pH值為7.5，55 ℃條件下分別酶解為2 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h、4 h，考察水解時(shí)間對(duì)水解效果的影響。

（6）復(fù)合酶最佳水解溫度的確定

（7）復(fù)合酶最佳水解pH的確定

固定復(fù)合酶添加量0.16g/10g原料，最佳水解溫度55℃，水解時(shí)間2.5 h，分別調(diào)整試液pH值分別為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5時(shí)，考察復(fù)合酶最適水解pH值。

1.3.3 白貝酶解液工藝參數(shù)的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以水解度（degree ofhydrolysis，DH）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，從而進(jìn)一步確定最佳酶解工藝參數(shù)。

表1 白貝肉漿酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for white shellfish pulp enzymatic hydrolysis condition optimization

1.3.4 酶解過程中pH值、氨基酸態(tài)氮含量、揮發(fā)性鹽基氮含量的變化

在最佳工藝條件下，選取0h、1h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5 h七個(gè)時(shí)間點(diǎn)，考查白貝酶解過程中pH值、氨基酸態(tài)氮含量、揮發(fā)性鹽基氮含量的變化情況。

1.3.5 測定方法

二是審查過程沒有相關(guān)規(guī)定。審查過程中如何對(duì)報(bào)備規(guī)章進(jìn)行審查的問題，《立法法》以及《法規(guī)規(guī)章備案條例》缺少明確的規(guī)定。《立法法》第九十九條規(guī)定了主動(dòng)審查條款，第一百條規(guī)定了審查意見的協(xié)商條款。各地對(duì)于報(bào)備規(guī)章的審查過程性規(guī)定也大體類似，如陜西規(guī)定省人大常委會(huì)審查機(jī)構(gòu)認(rèn)為報(bào)備規(guī)章存在問題的，應(yīng)向常委會(huì)主任會(huì)議提出審查意見和處理意見報(bào)告，對(duì)于市政府規(guī)章交市人大常委會(huì)處理。實(shí)踐中，通過協(xié)商溝通的方式提出意見交換看法，可以說是基于一種內(nèi)部溝通協(xié)商的柔性機(jī)制，剛性約束和監(jiān)督權(quán)威性不足，一方面有著中國特色的體制內(nèi)協(xié)商成本低的優(yōu)勢(shì)，另一方面降低了審查工作的嚴(yán)肅性和權(quán)威性，也降低了審查工作的效率。

pH值測定：利用PB-10型酸度計(jì)測定；揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）：采用微量擴(kuò)散法（參見GB 5009.228—2016的測定方法）[20]；總氮含量、總非蛋白氮：利用凱氏定氮法測定[21]；氨基酸態(tài)氮含量：采用中性甲醛電位滴定法測定[21]。水解度計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 白貝酶解單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同蛋白酶水解效果的比較結(jié)果

圖1 不同蛋白酶水解白貝效果比較Fig.1 Comparison of hydrolysis effect of white shellfish with different protease

由圖1可知，相比不添加蛋白酶，3種蛋白酶水解效果均較好，其中枯草中性蛋白酶的水解效果最好，水解度達(dá)到55.6%；其次是添加木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶，水解度分別為49.2%和32.5%。故選取枯草中性蛋白酶和木瓜蛋白酶進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.2 蛋白酶不同添加順序?qū)λ庑Ч挠绊?/p>

圖2 蛋白酶添加順序?qū)λ庑Ч挠绊慒ig.2 Effect of protease addition order on hydrolysis

從圖2可知，同時(shí)加入兩種蛋白酶時(shí)水解度為57.2%，先加枯草中性蛋白酶和先加木瓜蛋白酶的水解度分別為54.4%和48.6%。從圖2可以看出，加入方式對(duì)水解度具有顯著影響。原因可能是兩種酶的作用方式有所差別，另外，兩種酶在水解蛋白質(zhì)過程中，具有協(xié)同作用效果。故本試驗(yàn)后續(xù)采用同時(shí)加入兩種酶的方式來進(jìn)行。

2.1.3 復(fù)合蛋白酶添加比例對(duì)水解效果的影響

圖3 復(fù)合蛋白酶添加比例對(duì)水解效果的影響Fig.3 Effect of adding ratio of compound protease on hydrolysis

由圖3可知，隨著木瓜蛋白酶含量的增加水解度呈上升趨勢(shì)，比例達(dá)到1∶3時(shí)，水解效果最好，水解度達(dá)到59.6%，比例1∶4時(shí)水解效果有所下降?？赡苡捎谔砑颖壤秊?∶3時(shí)，兩種酶的協(xié)同作用最為明顯。故本試驗(yàn)選取枯草芽孢桿菌中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶為1∶3。

2.1.4 復(fù)合酶添加量對(duì)水解效果的影響

圖4 復(fù)合酶添加量對(duì)水解效果的影響Fig.4 Effect of compound enzyme addition on hydrolysis

由圖4可知，復(fù)合酶的添加量與水解效果呈正比例關(guān)系，隨著酶量的增加，水解度逐漸增加。當(dāng)酶加量達(dá)到0.16g/10g時(shí)，水解效果最好，水解度達(dá)到59.2%。隨著酶量的繼續(xù)增加，水解效果趨于平穩(wěn)。故本試驗(yàn)選取最適復(fù)合酶添加量為0.16 g/10 g。

2.1.5 復(fù)合酶酶解時(shí)間對(duì)水解效果的影響

圖5 酶解時(shí)間對(duì)水解效果的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis time on hydrolysis

由圖5可知，隨著水解時(shí)間的延長，水解度逐漸增高，水解時(shí)間為2.5 h時(shí)，水解度達(dá)到最高值59.6%，隨著水解時(shí)間的延長水解度趨于穩(wěn)定，即蛋白質(zhì)水解達(dá)到平衡。故本試驗(yàn)選取復(fù)合酶最佳的酶解時(shí)間為2.5 h。

2.1.6 復(fù)合酶酶解溫度對(duì)水解效果的影響

圖6 酶解溫度對(duì)水解效果的影響Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on hydrolysis

由圖6可知，酶解溫度對(duì)復(fù)合酶水解效果具有很大的影響，復(fù)合酶酶解溫度為50℃時(shí)，水解度達(dá)到59.8%。當(dāng)溫度達(dá)到55℃時(shí)，水解度略有下降不顯著。隨著溫度的升高，水解度呈下降的趨勢(shì)，說明更高的溫度已經(jīng)不適合復(fù)合酶的酶解作用。故本試驗(yàn)選取復(fù)合酶酶解溫度為50℃。

2.1.7 復(fù)合酶酶解pH值對(duì)水解效果的影響

圖7 酶解pH值對(duì)水解效果的影響Fig.7 Effect of enzymatic hydrolysis pH on hydrolysis

由圖7可知，當(dāng)反應(yīng)基質(zhì)初始pH為7.0和7.5時(shí)，水解效果比較好，pH值為7.5時(shí)水解度達(dá)到59.6%，隨著pH值的升高，水解效果顯著下降，原因是pH值改變會(huì)影響復(fù)合酶的本身活性，從而降低其水解效果。故本試驗(yàn)選取酶解pH值為7.5。

2.2 白貝酶解液最佳酶解條件的正交試驗(yàn)

表2 白貝肉漿酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for white shellfish pulp enzymatic hydrolysis condition optimization

從表2可知，最佳酶解條件組合為A3B3C2D1，即酶解溫度為55℃，酶解時(shí)間為3 h，酶解pH值為7.5，復(fù)合酶添加量為0.16 g/10 g。在此優(yōu)化條件下，酶解液水解度為60.02%。

根據(jù)極差R分析得出，4個(gè)因素對(duì)酶解效果的作用顯著性有不同，按影響大小分是A＞B＞C＞D，也就是說，溫度是影響整個(gè)酶水解的最重要因素，其次是時(shí)間和pH值，影響最小的是加酶量。

2.3 白貝肉漿酶解過程中pH值的變化

將白貝肉漿初始pH值調(diào)節(jié)為7.5，考查酶解過程中pH的變化，如圖8所示。由圖8可知，隨著時(shí)間的延長，酶解液的pH值在0～1.5 h之內(nèi)從7.5降至7.1，2 h后pH值降至6.9左右并趨于穩(wěn)定。原因是蛋白質(zhì)降解為氨基酸，從而改變酶解液的pH值。

圖8 白貝肉漿酶解過程中pH值的變化Fig.8 Changes of pH during enzymatic hydrolysis of shellfish meat pulp

2.4 白貝肉漿酶解過程中氨基酸態(tài)氮含量的變化

白貝肉漿中蛋白質(zhì)在水解過程中，蛋白質(zhì)開始水解為氨基酸，如圖9所示，整個(gè)過程中，氨基酸態(tài)氮含量呈先上升后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，說明隨著時(shí)間的進(jìn)行氨基酸含量逐步增加，到2.5 h達(dá)到最高值1.26 g/100 mL，繼續(xù)水解氨基酸態(tài)氮含量趨于穩(wěn)定，說明水解達(dá)到平衡狀態(tài)，此含量已經(jīng)達(dá)到特級(jí)醬油的標(biāo)準(zhǔn)，所以白貝水解液作為調(diào)味液是具有潛力的。

圖9 白貝肉漿酶解過程中氨基酸態(tài)氮含量的變化Fig.9 Changes of amino acid nitrogen content during enzymatic hydrolysis of shellfish meat pulp

2.5 白貝肉漿酶解過程中揮發(fā)性鹽基氮的變化

揮發(fā)性鹽基氮是衡量水產(chǎn)品腐敗的一個(gè)重要指標(biāo)，GB/T 21999—2008《蠔油》中規(guī)定揮發(fā)性鹽基氮的含量應(yīng)≤50mg/100mL。由圖10可知，本試驗(yàn)中揮發(fā)性鹽基氮從水解開始逐步呈上升的趨勢(shì)，2.5h達(dá)到最大值12.32mg/100mL，繼續(xù)水解其含量趨于穩(wěn)定。說明整個(gè)生產(chǎn)過程揮發(fā)性鹽基氮含量相對(duì)較低，符合國標(biāo)的要求。

圖10 白貝肉漿酶解過程中揮發(fā)性鹽基氮含量的變化Fig.10 Changes of volatile base nitrogen content during enzymatic hydrolysis of shellfish meat pulp

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)研究表明，白貝酶解調(diào)味液最佳工藝條件為采用同時(shí)加入枯草芽孢桿菌中性蛋白酶和木瓜蛋白酶兩種酶，添加比例為1∶3，總加酶量為0.16 g/10 g原料，水解溫度為55℃，時(shí)間為3 h，初始pH值為7.5，在此條件下，所得水解度為60.02%。酶解過程中pH從初始7.5逐步降低，2 h后降至6.9并趨于穩(wěn)定；氨基酸態(tài)氮含量呈逐漸升高的趨勢(shì)，2.5 h達(dá)到最高值1.26 g/100 mL，而后趨于穩(wěn)定；揮發(fā)性鹽基氮也呈先升高后穩(wěn)定的趨勢(shì)，2.5 h后達(dá)到最高峰12.32 mg/100 mL。