劉苑琳，李 輝，張 衡，楊 華，劉玲彥，鄧娟娟，，盧 發(fā)，柳志杰，熊麗嬌，許引虎，*

（1.湖北工業(yè)大學 生物工程與食品學院，湖北 武漢 430064；2.湖北省酵母功能重點實驗室，湖北 宜昌 443003；3.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 4430034；4.湖北省宜昌市中心人民醫(yī)院，湖北 宜昌 443003）

商業(yè)酵母為了便于儲存、運輸和方面操作使用，在酵母生產(chǎn)過程中會對酵母細胞進行脫水干燥處理，最終制成含水量多數(shù)為4.0%～8.0%的活性干酵母，而自然狀態(tài)的正常酵母細胞含水量多在70.0%左右[1]。在酵母生產(chǎn)的干燥脫水環(huán)節(jié)，會采用多種物理和生物工程技術，使酵母細胞失去所有的自由水和大部分的結合水，水分的缺失導致細胞膜水化層的喪失，進而失去正常的代謝功能及生長能力[2]。因此活性干酵母在進行接種發(fā)酵或者繁殖代謝前，首先必須吸收大量水分使酵母細胞恢復至原來自然狀態(tài)的含水量，此即為復水，或稱之為再水化。復水后的酵母細胞，再經(jīng)過一定時間的適應性培養(yǎng)，恢復至自然狀態(tài)酵母細胞本該具有的正常生理代謝功能，此即為活化[1]。由于酵母細胞膜水化層的喪失，導致酵母細胞膜磷脂雙分子層的紊亂，細胞膜的滲透性也會增加，失去選擇透過性，因此在活性干酵母復水活化的過程中會伴隨著胞內無機化合物、氨基酸、核苷酸、酯類等生物活性物質的大量滲透流失，特別是在低溫或高滲透壓的環(huán)境中這種細胞內含物的流失會更加嚴重，這將直接影響到酵母細胞的活性。因此在傳統(tǒng)釀酒工藝中，通常將活性干酵母經(jīng)過復水活化后再添加到發(fā)酵醪中啟動酒精發(fā)酵[3-5]，這種操作可以使活性干酵母細胞從干縮休眠狀態(tài)恢復到正常細胞形態(tài)，另外也可以避免活性干酵母直接接觸低溫、高滲透壓的不利環(huán)境，減輕不利或脅迫因子對酵母細胞的損傷，有利于酵母快速啟動酒精發(fā)酵，保障酒精發(fā)酵過程的順利啟動、徹底完成，此工序已成為釀酒行業(yè)公認的基本操作流程。但近年來，為了節(jié)省工廠操作工序、減輕車間工作量，使釀造簡便化，也有少部分葡萄酒生產(chǎn)者在嘗試對活性干酵母不進行活化，直接投到發(fā)酵醪中啟動酒精發(fā)酵。

甘油即丙三醇，是釀酒酵母酒精發(fā)酵過程中主要的代謝產(chǎn)物之一，僅次于乙醇和二氧化碳。甘油對于釀酒酵母具有重要的生理調節(jié)作用，當酵母細胞處于高滲透壓的不利環(huán)境時，甘油會在細胞內快速的合成和積累以維持細胞內外的滲透壓平衡[6]。另外甘油合成是酵母在厭氧或微氧條件下調節(jié)酵母細胞內氧化還原電勢平衡的重要途徑之一[7-8]。甘油在酵母酒精發(fā)酵過程中產(chǎn)生，通常含量在1～15 g/L，被灰霉菌侵染的葡萄釀造的葡萄酒中，甘油含量會更高，如貴腐葡萄酒中甘油含量可達25 g/L[9]。甘油的生成會消耗一部分碳源，有研究表明，每生產(chǎn)100 g乙醇會產(chǎn)生5g甘油。所以在工業(yè)酒精的生產(chǎn)中會想方設法降低酒精發(fā)酵過程中甘油的產(chǎn)量[10-12]，但在葡萄酒生產(chǎn)過程中甘油會給葡萄酒帶來更加圓潤、飽滿的酒體，提高葡萄酒的綜合感官品質[13-14]，并且在全球變暖的大環(huán)境下，全球多個產(chǎn)區(qū)的釀酒葡萄成熟期的糖度越來越高，隨之帶來葡萄酒酒度增高[15-16]，過高的酒精度會給葡萄酒帶來苛性感或不平衡性，如果葡萄酒酵母在酒精發(fā)酵過程中能適當增加甘油的生成量，降低酒精生成率，反而會使葡萄酒更加的圓潤、舒適、易飲。

為了研究葡萄酒酵母活化工藝與直投工藝對酒精發(fā)酵及甘油代謝的影響，本項目選取國內外多個品牌的不同品種的葡萄酒活性干酵母進行釀酒試驗，驗證其在常規(guī)發(fā)酵醪中、不同溫度發(fā)酵條件下的差異性，為葡萄酒活性干酵母的合理使用提供一定的科學理論和應用參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與菌株

赤霞珠葡萄汁：總糖231.5 g/L，pH 3.5，總酸（以酒石酸計）5.3 g/L，市售；葡萄酒活性干酵母CECA、MST（釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae））：安琪酵母股份有限公司；葡萄酒活性干酵母F1、F2（釀酒酵母（Saccharomyces cere visiae））：法國某公司；葡萄酒活性干酵母A1、A2（釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae））：加拿大某公司。所選6種葡萄酒活性干酵母均為單一純種。

1.1.2化學試劑

L-酒石酸（分析純）：上海源葉生物科技有限公司；甘油（分析純）：美國Sigma公司；無水乙醇（色譜純）、硫酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

LRH-系列生化培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；BSA2202S電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；LKTC-B1-T恒溫水浴鍋：金壇市城東新瑞儀器廠；PHS-3C酸度計：上海儀電科學儀器股份有限公司；ZORBAX碳水化合物分析柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、HP1100高效液相色譜儀（具有示差折光檢測器和自動進樣器）：美國安捷倫公司；SHZ曲型循環(huán)水真空泉：鄭州長城科工貿有限公司；KQ100DB型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母活化液制備

所有酵母采用200 mg/L的接種量，將稱量好的活性干酵母提前放入10 mL的試管中，然后按照常規(guī)活化工藝規(guī)程，加入10倍酵母質量的38℃去離子水，使葡萄酒活性干酵母溶解完全，將帶有復水活化液的試管放入38℃的恒溫水浴鍋中活化20 min，再逐步加入少量的葡萄汁，待酵母活化液的溫度降至與葡萄汁溫差在10℃以內時，將酵母活化液接種到裝有葡萄汁的500 mL三角瓶中，每瓶裝300 mL葡萄汁，每個樣品兩個重復。

1.3.2 酒精發(fā)酵

傳統(tǒng)的葡萄酒發(fā)酵生產(chǎn)中最常見的酒精發(fā)酵溫度多在13～18℃或23～29℃兩個溫度區(qū)間進行，所以本實驗的酒精發(fā)酵溫度設置為15℃和25℃。將接種好的葡萄汁處理樣分別在15℃和25℃條件下恒溫靜置發(fā)酵，活化處理與直投處理25℃培養(yǎng)分別用“H-”和“G-”標示；活化處理與直投處理15℃培養(yǎng)分別用“H15-”和“G15-”標示。每隔24 h在同一時間點測定一次發(fā)酵處理樣的質量，發(fā)酵前后的質量差代表CO2的生成量，并根據(jù)每天的CO2生成量繪制發(fā)酵曲線。當24 h間隔CO2的生成量＜1.0 g時，可以判定酒精發(fā)酵基本結束。每個處理樣設置2個重復，為了保證15℃的發(fā)酵模擬環(huán)境接近生產(chǎn)實際，確保數(shù)據(jù)準備可信，要求接種時的葡萄汁發(fā)酵液的溫度也低于15℃。

1.3.3 酒樣常規(guī)理化指標測定

酒精、殘?zhí)?、總酸、揮發(fā)酸：參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析法》[17]。

1.3.4 甘油含量的測定

發(fā)酵樣品的處理：將發(fā)酵樣品在取樣容器中混勻，取混勻后的適量樣品4 000 r/min離心10 min，精密稱取一定質量離心后的上清液至容量瓶中，用純水定容并稀釋合適的倍數(shù)，使其濃度在曲線范圍內，將稀釋后溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后上機測試。

高效液相色譜條件：用0.005 mol/L H2SO4溶液作為流動相，流速為0.6 mL/min，柱溫65℃，平衡流動相待儀器基線走平穩(wěn)后進樣，進樣量為20 μL。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

運用SPSS 22.0進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵曲線結果與分析

3個品牌6個品種的葡萄酒活性干酵母的發(fā)酵曲線如圖1。

圖1 不同條件下安琪葡萄酒酵母（A）、法國葡萄酒酵母（B）、加拿大葡萄酒酵母（C）發(fā)酵曲線Fig.1 Fermentation curve of Angel wine yeast(A),French wine yeast(B)and Canada wine yeast(C)under different fermentation conditions

從圖1可以看出，在25℃發(fā)酵條件下，6種葡萄酒酵母在發(fā)酵的第1天活化接種的酵母發(fā)酵速度比直投接種快31.5%～50.9%；在發(fā)酵的第2天發(fā)酵速度達到最快，此時直投酵母的發(fā)酵速度開始快于活化處理。加拿大A酵母在發(fā)酵的第1天活化接種的發(fā)酵速度要快于直投工藝39.6%～43.1%；在發(fā)酵的第2天發(fā)酵速度達到最大，此時活化處理的葡萄酒酵母發(fā)酵速度仍快于直投處理，活化接種和直投工藝均在同一天完成了酒精發(fā)酵。在15℃發(fā)酵條件下，6種酵母無論是活化接種還是直投接種在接種的第1天單日質量損失均＜0.5 g，且差異不大、發(fā)酵速度極慢，在接種后的第2天安琪葡萄酒酵母和法國葡萄酒酵母的單日質量損失開始快速增加，其中所選2種安琪葡萄酒酵母活化接種要比直投接種單日質量損失高71%，F(xiàn)1和F2酵母接種第2天單日質量損失活化接種比直投接種分別高24%和53%。加拿大2種葡萄酒酵母在接種后第2天單日質量損失仍然＜0.5 g，活化接種比直投接種單日質量損失高30%左右。除直投處理的A1酵母外，單日最大質量損失均在接種后第4天，此時活化與直投的發(fā)酵速度差距明顯縮小，單日質量損失相差不大。在低溫15℃發(fā)酵條件下，6種酵母起酵速度均比較慢，尤其直投的酵母起酵速度更慢。

從發(fā)酵曲線可以看到，無論是在25℃還是在15℃發(fā)酵條件下，相比活化工藝，直投工藝都會明顯的引起起酵速度緩慢、滯后。研究表明，將活性干酵母置于35～43℃復水有助于細胞膜轉變回液晶狀態(tài)并使內含物泄漏最小化[18]，因此通常在葡萄酒酵母接種前釀酒師會選用35～38℃條件復水，然后再補充適當葡萄汁活化，或者直接用4%～5%的糖水溶液復水活化。如果復水溫度低于30℃，酵母細胞的活性損失將會很大，特別是對沒添加保護劑的活性干酵母損害會更大。而沒有經(jīng)過科學的復水活化的活性干酵母在直接投入到發(fā)酵液后面對低溫、高滲透壓等不利環(huán)境，酵母細胞內含物的流失會更加的嚴重[19]，隨之帶來更大的酵母活性損失，這也是葡萄酒活性干酵母經(jīng)活化后接種比直投接種起酵快的原因之一。

由于葡萄酒發(fā)酵多在5 d以上，所以起酵速度一般不影響中、后期的酒精發(fā)酵，因此從圖1可以看出，安琪酵母和法國酵母無論是在15℃還是在25℃發(fā)酵條件下，當發(fā)酵速度達到峰值時，直投工藝的發(fā)酵速度開始超過活化處理的樣品，并且在中期也是如此，直到發(fā)酵末期直投酵母和活化酵母發(fā)酵速度趨于一致。在25℃發(fā)酵條件下所有的酵母無論是活化接種還是直投接種均在同一天結束發(fā)酵。在15℃條件下，安琪酵母活化接種與直投接種均在同一天結束發(fā)酵；但是所選的法國酵母在15℃培養(yǎng)條件下直投工藝均比活化晚1～2 d結束酒精發(fā)酵；加拿大葡萄酒酵母在發(fā)酵速度達到峰值時仍是活化酵母的發(fā)酵速度高于直投工藝，在酒精發(fā)酵中后期才表現(xiàn)出直投酵母發(fā)酵速度高于活化酵母，在發(fā)酵末期兩種接種工藝的發(fā)酵速度趨于一致，但在15℃培養(yǎng)條件下A2酵母的直投工藝要比活化工藝晚1 d結束發(fā)酵，由此可見直投接種會導致部分商業(yè)葡萄酒酵母發(fā)酵時間延長、拖后。

2.2 常規(guī)理化指標結果與分析

對6種葡萄酒酵母不同接種方法、不同發(fā)酵溫度條件下的酒樣進行常規(guī)理化分析。從表1可知，在15℃發(fā)酵條件下，除F1和F2酵母直投接種最終酒樣殘?zhí)堑陀诨罨臃N酒樣，其他酵母均表現(xiàn)出活化接種的最終殘?zhí)堑陀谥蓖督臃N，總酸（酒石酸計）、酒精度、揮發(fā)酸含量差異不大，均符合國標要求。在15℃條件下只有H-MST和G15-F1酒樣最終殘?zhí)呛浚? g/L，其他均未發(fā)酵徹底，另外從圖1可以看到，在15℃發(fā)酵條件下，安琪酵母MST活化接種和直投接種均在同一天結束發(fā)酵，而F1酵母活化接種要比直投接種晚1天結束發(fā)酵，可能F1酵母在CO2單日產(chǎn)量＜1 g后酵母還在緩慢的進行發(fā)酵，所以活化接種的殘?zhí)欠炊笥谥蓖督臃N。由此可見，在15℃發(fā)酵條件下，不同的葡萄酒酵母采用不同的接種工藝會影響到最終能否發(fā)酵完全徹底。從表2可知，在25℃酒精發(fā)酵條件下，6種酵母無論采用活化接種工藝還是直投工藝，均能徹底完成酒精發(fā)酵，殘?zhí)呛烤? g/L，總酸（酒石酸計）、酒精度、揮發(fā)酸含量差異不大，均符合國標要求。

表1 15℃發(fā)酵結束后酒樣常規(guī)理化指標Table 1 Conventional physical and chemical indexes of wine samples after fermentation under 15℃

表2 25℃發(fā)酵結束后酒樣常規(guī)理化指標Table 2 Conventional physical and chemical indexes of wine samples after fermentation under 25℃

2.3 甘油產(chǎn)量結果與分析

從圖2可知，在15℃發(fā)酵條件下，除F1酵母外，其他5種酵母采用活化接種的樣品最終甘油產(chǎn)量均顯著高于直投接種的樣品（P＜0.05），其中以F2酵母最為明顯，其活化接種比直投接種的甘油產(chǎn)量高出8%。從圖2可知，在25℃培養(yǎng)條件下除F1和A2酵母外，其他4種酵母經(jīng)活化接種的甘油產(chǎn)量均顯著的高于直投接種的樣品，其中A1酵母活化接種比直投接種的甘油高出10.5%。F1酵母無論是在15℃還是在25℃酒精發(fā)酵條件下采用活化與直投接種工藝酵母產(chǎn)生的甘油產(chǎn)量均無顯著差異。而A2酵母在15℃發(fā)酵條件下活化接種發(fā)酵酒產(chǎn)生的甘油高于直投接種，但在25℃發(fā)酵條件下，活化接種的發(fā)酵酒甘油產(chǎn)量反而低于直投接種。有相關報道，酵母在酒精發(fā)酵過程中甘油的產(chǎn)量受溫度、pH、葡萄原料、酵母菌種等多種因素的影響[20]。本實驗中采用相同的葡萄汁、同一發(fā)酵溫度進行酒精發(fā)酵，甘油的產(chǎn)量一方面因不同的酵母菌株而異，另一方面活化處理的甘油產(chǎn)量高于直投工藝，有可能是活性干酵母經(jīng)過活化后能夠相對快速的恢復到正常的生理狀態(tài)并開始正常的甘油代謝有關。

圖2 6種酵母15℃（A）和25℃（B）條件下不同接種工藝甘油產(chǎn)量Fig.2 Yield of glycerol in different inoculation processes of 6 yeasts at 15 °C(A)and 25 °C(B)

3 結論

本實驗中，采用活化處理接種的葡萄酒活性干酵母起酵速度要明顯的快于直投工藝。在15℃發(fā)酵條件下，部分活性干酵母直投接種比活化接種晚一天結束發(fā)酵；F1酵母活化與直投處理間甘油產(chǎn)量沒有顯著差異（P＞0.05），其他5種酵母活化工藝發(fā)酵的葡萄酒甘油產(chǎn)量顯著高于直投工藝（P＜0.05）；在25℃發(fā)酵條件下，活化接種和直投接種均在同一天完成酒精發(fā)酵，最終殘?zhí)呛烤? g/L；F1酵母活化與直投接種之間的甘油產(chǎn)量沒有顯著的差異，A2酵母活化接種后葡萄酒的甘油產(chǎn)量顯著低于直投工藝，其他4種葡萄酒活性干酵母活化后的甘油產(chǎn)量明顯高于直投工藝。因此綜合考慮，與活化后接種相比，直投接種可能延長發(fā)酵時間，降低甘油產(chǎn)量。