王珊珊，吳 昊，司月陽，李 玲，付玉潔*，李 丹

（沈陽工學(xué)院 生命工程學(xué)院，遼寧 撫順 113122）

甘蔗（Saccharum officinarum）有“果中佳品”的美稱，其含有較多的鐵元素，故又稱“補(bǔ)血果”，甘蔗中還含有大量人體必需的其他微量元素和利于人體健康的氨基酸和維生素類物質(zhì)[1]。同時(shí)甘蔗可改善口干舌燥、消化不良，反胃嘔吐、肺熱咳嗽等癥狀，研究表明，甘蔗中含有多糖[2]、黃酮[3]及多酚[4]等活性物質(zhì)，使甘蔗具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、降血糖、降血脂的功能[5-6]。甘蔗含糖量約為14%～16%[7]，利用甘蔗汁生產(chǎn)酒精不僅可以節(jié)約糧食，而且質(zhì)量高，產(chǎn)量大[8-9]。

菠蘿（Ananas comosus）學(xué)名鳳梨，屬鳳梨科鳳梨屬植物，是熱帶和亞熱帶地區(qū)的著名水果[10]。菠蘿營(yíng)養(yǎng)豐富，有較高含量的糖、蛋白質(zhì)和脂肪等，還含有大量維生素，其中以維生素C含量最高[11]。此外，菠蘿中含有一種叫“菠蘿朊酶”的特殊物質(zhì)，既有溶解阻塞的血凝塊和纖維蛋白、改善局部的血液循環(huán)的作用[12]，還能有效的酸解脂肪，起到減肥的效果[13]。近幾年隨著對(duì)菠蘿的不斷研究，已經(jīng)從菠蘿中提取出多種物質(zhì)，如黃酮[14]、多酚[15]及蛋白酶[16]等物質(zhì)，但是其提取率較低，還需要進(jìn)一步對(duì)其提取工藝進(jìn)行研究。果酒是一種以水果為原料，經(jīng)過酵母利用水果本身的糖分發(fā)酵后得到一種低酒精濃度的酒精飲料[17]，其含有豐富的多酚類物質(zhì)、氨基酸及礦物質(zhì)等。近年來，研究人員對(duì)于混合型果酒的研究進(jìn)一步加深，研制出了多種多樣的新型混合果酒。如劉興艷等[18]以青梅與甘蔗為原料，成功釀造出一款口味獨(dú)特，果香濃郁的低度混合型果酒；李鳳霞等[19]確定了香蕉菠蘿復(fù)合果酒的最佳工藝參數(shù)，其釀造的混合型果酒有清新果香味，口感飽滿爽口，深受人們喜愛。而甘蔗菠蘿復(fù)合果酒還鮮有報(bào)道。

本研究以甘蔗和菠蘿為原料制作復(fù)合型果酒，以感官評(píng)價(jià)為考察指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)確定復(fù)合型果酒釀造過程的主要影響因子，采用中心組合設(shè)計(jì)（central composite design，CCD）響應(yīng)面分析法對(duì)甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒的釀造工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其理化指標(biāo)及微生物指標(biāo)進(jìn)行分析，為甘蔗及菠蘿資源的深度開發(fā)開辟了新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

菠蘿、甘蔗：撫順市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；安琪果酒酵母（食用級(jí)）：宜昌安琪酵母股份公司。

1.1.2 試劑

蔗糖（食用級(jí)）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；果膠酶（50000U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；食鹽（食用級(jí)）：四川省鹽業(yè)總公司；白砂糖（食用級(jí)）：太古糖業(yè)（中國(guó)）有限公司；偏重亞硫酸鉀（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；維生素C、葡萄糖（均為食用級(jí)）：石藥集團(tuán)維生藥業(yè)石家莊有限公司；檸檬酸（食用級(jí)）：河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH 7.4～7.6，121 ℃、101 kPa滅菌20 min[20]。

1.2 儀器與設(shè)備

LD210-2R型電子分析天平：沈陽龍騰電子有限公司；DL-1萬用電爐：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；MM721AAU-PW微波爐：廣東美的微博電器制造有限公司；YXQ-LS-50S11高壓蒸汽滅菌鍋、SW-CJ-2FD無菌操作臺(tái)、HPX-9052MBE恒溫培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；KYC1112恒溫振蕩器：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TDL-40B離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；721G型可見分光光度計(jì)：上海精科儀器有限公司；PB-10酸度計(jì)：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；SJN-WZ101型糖度儀：北京西化儀科技有限公司；WGZ-1B濁度儀：鄭州南北儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒釀造工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

原料挑選：挑選表面無破損腐爛的且成熟度適中的甘蔗和菠蘿。

甘蔗去皮、清洗、榨汁：甘蔗去皮后切成1 cm2的果塊，然后將其置于2%鹽水中浸泡10 min，除去甘蔗果肉中引起過敏的物質(zhì)。

菠蘿去皮、清洗：菠蘿去皮后切成1 cm2的果塊，然后將其置于2%鹽水中浸泡10 min，除去菠蘿果肉中引起過敏的物質(zhì)。

菠蘿打漿及酶解：用榨汁機(jī)將經(jīng)過處理的果肉打成漿狀，每100mL添加0.05mg的果膠酶，在25℃條件下酶解6h，分解果肉組織中的果膠，提高出汁率。

護(hù)色：甘蔗打漿后應(yīng)立即護(hù)色，防止果汁氧化褐變[19]。按果汁質(zhì)量加入0.5%的檸檬酸和0.5%維生素C進(jìn)行護(hù)色。

混合：將處理好的甘蔗汁與菠蘿汁按照1∶2的體積比倒入發(fā)酵瓶?jī)?nèi)，并攪拌均勻。

成分調(diào)整：向混合后的果汁中加入一定量的白砂糖。

過濾：將酶解后果肉漿用滅菌的紗布進(jìn)行過濾，得果汁。

殺菌：向果汁中添加偏重亞硫酸鉀進(jìn)行殺菌，備用。

酵母活化：將2.0 g果酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）加入5%的葡萄糖溶液中，混合均勻，35℃條件下恒溫水浴活化30 min。

接種：將活化后的酵母溶液加入到混合果汁中，并攪拌均勻。

主發(fā)酵：在26℃條件下進(jìn)行主發(fā)酵，發(fā)酵過程中及時(shí)進(jìn)行攪拌，以便完全發(fā)酵。

后發(fā)酵：主發(fā)酵結(jié)束后，將酒液進(jìn)行過濾，置于一定溫度條件下進(jìn)行后發(fā)酵。

陳釀：果酒繼續(xù)密封保存，于20℃條件下陳釀2月，得甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒。

1.3.2 甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒的感官評(píng)價(jià)

隨機(jī)選取10名經(jīng)專業(yè)感官評(píng)定訓(xùn)練的同學(xué)對(duì)甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒進(jìn)行感官評(píng)分，滿分100分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1[21]。

表1 甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of sugarcane and pineapple compound fruit wine

1.3.3 甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒釀造工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

按照甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒釀造工藝依次考察主發(fā)酵溫度（20℃、22℃、24℃、26℃、28℃）、甘蔗汁與菠蘿汁體積比（4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4）、白砂糖添加量（160 g/L、180 g/L、200 g/L、220 g/L、240 g/L、260 g/L、280g/L）、酵母接種量（60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、110g/L、120g/L）、主發(fā)酵時(shí)間（4 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d、10 d）對(duì)甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒感官評(píng)分的影響。

1.3.4 甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒釀造工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以甘蔗汁與菠蘿汁體積比（A）、白砂糖添加量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）、酵母接種量（D）為考察因素，感官評(píng)分（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按照CCD設(shè)計(jì)原理，運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表2。

表2 甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒釀造工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface methodology for brewing process optimization of sugarcane and pineapple compound fruit wine

1.3.5 甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒質(zhì)量指標(biāo)的測(cè)定

（1）理化指標(biāo)

酒精度：參考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的酒精計(jì)法測(cè)定；糖度：采用手持糖度儀測(cè)定[19]；酸度：采用PB-10酸度計(jì)測(cè)定[20]；濁度：采用WGZ-1B濁度儀測(cè)定[24]。

（2）微生物指標(biāo)

采用傾注平板菌落計(jì)數(shù)法[21]，用滅菌后的吸管吸取1 mL待測(cè)酒樣于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中，在36℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24～28 h，再參照GB/T 5750.12—2006《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法微生物指標(biāo)》計(jì)數(shù)原則進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒釀造工藝條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 主發(fā)酵溫度對(duì)甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒品質(zhì)的影響

圖1 主發(fā)酵溫度對(duì)甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒感官評(píng)分的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on sensory evaluation of sugarcane and pineapple compound fruit wine

由圖1可知，隨著發(fā)酵溫度的逐漸升高，感官評(píng)分先升高后降低。當(dāng)發(fā)酵溫度為26℃時(shí)，甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒的感官評(píng)分最高，為76分。發(fā)酵溫度過低時(shí)，果酒酵母的活性降低，不能進(jìn)行有效的發(fā)酵，酒精度過低，影響口感；而溫度過高會(huì)使果酒酵母失活，無法進(jìn)行發(fā)酵。因此，可確定最佳的甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒發(fā)酵溫度為26℃，此時(shí)甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒的酒精度為8.94%vol。

2.1.2 甘蔗汁與菠蘿汁的果汁配比對(duì)甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒品質(zhì)的影響

圖2 果汁配比對(duì)甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒感官評(píng)分的影響Fig.2 Effect of fruit juice ratio on sensory evaluation of sugarcane and pineapple compound fruit wine

由圖2可知，隨著甘蔗菠蘿復(fù)合果汁中菠蘿汁比例的提高，感官評(píng)分先升高后降低。當(dāng)甘蔗汁與菠蘿汁體積比為1∶2時(shí)，甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒的感官評(píng)分最高，為84分。當(dāng)甘蔗汁過多時(shí)，其酒液澄清度不高，口味過甜，影響外觀及口感；菠蘿汁過多時(shí)，酒液顏色偏黃，酒精度較低且口感較酸，因此，確定甘蔗汁與菠蘿汁的最佳體積比為1∶2，此時(shí)甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒的酒精度為9.88%vol。

2.1.3 白砂糖添加量對(duì)甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒品質(zhì)的影響

圖3 白砂糖添加量對(duì)甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒感官評(píng)分的影響Fig.3 Effect of sugar addition on sensory score of sugarcanepineapple compound fruit wine

由圖3可知，隨著白砂糖添加量在160～280 g/L范圍內(nèi)的升高，感官評(píng)分先升高后降低。當(dāng)白砂糖添加量為240g/L時(shí)，甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒的評(píng)分最高，為86分。當(dāng)白砂糖添加量過低時(shí)，其酒液口感發(fā)澀；而白砂糖添加量過高時(shí)，由于初始時(shí)局部產(chǎn)生的酒精過多導(dǎo)致酵母菌死亡，不能繼續(xù)產(chǎn)生酒精，導(dǎo)致其酒精度較低，同時(shí)初始糖度過高使酒液過甜，影響口感。因此，最佳白砂糖添加量為240 g/L，此時(shí)甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒的酒精度為10.12%vol。

2.1.4 酵母接種量對(duì)甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒品質(zhì)的影響

圖4 酵母接種量對(duì)甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒感官評(píng)分的影響Fig.4 Effect of yeast inoculum on sensory evaluation of sugarcane and pineapple compound fruit wine

由圖4可知，隨著酵母接種量在60～120 g/L范圍內(nèi)不斷提高，感官評(píng)分先升高后降低。當(dāng)酵母接種量為100 g/L時(shí)，混合型果酒的評(píng)分最高，為78分。當(dāng)酵母接種量過少時(shí)，酒液度不高，口味平淡，欠濃郁，影響口感；而酵母接種量過多時(shí)，酒精度較高，掩蓋了原有的果香味。因此，最佳酵母添加量為100 g/L，此時(shí)甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒的酒精度為9.18%vol。

2.1.5 主發(fā)酵時(shí)間對(duì)混合型果酒品質(zhì)的影響

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒感官評(píng)分的影響Fig.5 Effect of fermentation time on sensory evaluation of sugarcane and pineapple compound fruit wine

由圖5可知，隨著主發(fā)酵時(shí)間在4～10 d范圍內(nèi)不斷增加，感官評(píng)分先升高后降低。當(dāng)主發(fā)酵時(shí)間為6 d時(shí)，混合型果酒的評(píng)分最高，為81分。發(fā)酵時(shí)間過短，其酒液發(fā)酵不完全，酒味不濃，口味平淡且有較多雜質(zhì)，影響外觀及口感。發(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng)，酒精度過高，酒味過濃掩蓋了水果的香味，有強(qiáng)烈殺口感。因此，最佳發(fā)酵時(shí)間為6 d，此時(shí)甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒的酒精度為9.53%vol。

2.2 甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒釀造工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 回歸模型的建立及方差分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒感官評(píng)分（Y）為響應(yīng)值，甘蔗汁與菠蘿汁體積比（A）、白砂糖添加量（B）、主發(fā)酵時(shí)間（C）及酵母接種量（D）為考察因素進(jìn)行4因素5水平的CCD試驗(yàn)。響應(yīng)面分析結(jié)果與分析見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表3 甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒釀造工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of response surface methodology for brewing process optimization of sugarcane and pineapple compound fruit wine

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表3試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得以甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒的感官評(píng)分為響應(yīng)值的回歸方程：

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4可知，回歸模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），回歸模型的決定系數(shù)R2=0.978 4，調(diào)整系數(shù)R2Adj=0.958 3，說明該回歸模型與試驗(yàn)擬合較好，可以用于對(duì)甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒感官評(píng)分的理論預(yù)測(cè)。從回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，各因素對(duì)甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒感官評(píng)價(jià)影響程度依次為果汁配比（A）＞發(fā)酵時(shí)間（C）＞白砂糖添加量（B）＞初始糖度（D）。一次項(xiàng)A、D、交互項(xiàng)AD、BC、CD及二次項(xiàng)A2、B2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)B、C及交互項(xiàng)BD對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），其他相對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

2.2.2 響應(yīng)面曲面圖分析

對(duì)甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒感官評(píng)分影響顯著的交互作用的響應(yīng)面及等高線見圖6。

由圖6可知，隨著各因素水平的增大，響應(yīng)值呈先升高后減小的趨勢(shì)。交互項(xiàng)AD、BC和CD對(duì)感官評(píng)分影響的響應(yīng)面均呈現(xiàn)拋物面，即說明3個(gè)交互項(xiàng)所在選取的試驗(yàn)范圍內(nèi)，響應(yīng)值均存在極大值。等高線均呈橢圓形，即說明3個(gè)交互項(xiàng)對(duì)結(jié)果影響顯著，與方差分析結(jié)果一致。

圖6 各因素交互作用對(duì)甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒感官評(píng)分影響的響應(yīng)面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on sensory evaluation of sugarcane and pineapple compound fruit wine

運(yùn)用Design Expert 8.0.6的響應(yīng)面分析軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，得到混合型果酒的最優(yōu)釀造條件：甘蔗汁菠蘿汁體積比為1∶2、白砂糖添加量225.8 g/L、發(fā)酵時(shí)間7 d、酵母接種量100 g/L。在此最優(yōu)條件下，甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒感官評(píng)分最大預(yù)測(cè)值為97.96分。為實(shí)際操作方便，將上述最優(yōu)釀造條件修訂為甘蔗汁菠蘿汁體積比為1∶2、白砂糖添加量225 g/L、發(fā)酵時(shí)間7 d、酵母接種量100 g/L，按上述釀造工藝制作甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，得到甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒感官評(píng)分的平均值為96.50分，與預(yù)測(cè)值接近，說明此響應(yīng)面法優(yōu)化得到的甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒釀造工藝在實(shí)踐中可行。

2.3 甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒的質(zhì)量指標(biāo)測(cè)定

在最優(yōu)釀造工藝條件下，制備甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒，測(cè)定其理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)，理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果表明，酒精度為10.84%vol，pH值為4.13，糖度為10 °Bx，濁度值為57.9JTU，符合GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。微生物測(cè)定結(jié)果表明，細(xì)菌總數(shù)75個(gè)/mL。細(xì)菌總數(shù)≤100個(gè)/mL符合GB/T 5750.12—2006《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法微生物指標(biāo)》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒的釀造工藝，確定最優(yōu)釀造工藝為：甘蔗汁與菠蘿汁體積比1∶2、白砂糖添加量為225 g/L、發(fā)酵時(shí)間7 d、酵母接種量為100 g/L、發(fā)酵溫度為26℃。在此優(yōu)化條件下，所得的甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒色澤金黃，澄清透明，雜質(zhì)較少，狀態(tài)均勻穩(wěn)定；氣味適宜，含有菠蘿和甘蔗獨(dú)特的甜香味；口感香甜爽口，酸甜適中，回味愉快，沒有異味，感官評(píng)分為96.5分。其酒精度為7%vol，酸度為4.13，糖度為10°Bx，濁度值為57.9JTU，細(xì)菌總數(shù)為75個(gè)/mL，理化指標(biāo)及微生物指標(biāo)均符合相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。本試驗(yàn)為甘蔗菠蘿復(fù)合型果酒產(chǎn)品的釀造奠定基礎(chǔ)，為甘蔗及菠蘿資源的深度開發(fā)開辟了新的途徑。