段第生，蔣立文*，黃 鋒，雷紫依，陳 中，楊子露

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128）

南燭（Lyonia ovalifolia）又名烏飯樹（Vaccinium bracteatum Thunb）。其為杜鵑花科、越橘屬常綠灌木或喬木，在我國分布范圍很廣，尤以華東、中南至西南以及臺灣等地居多[1]。南燭葉在民間的食用歷史悠久[2-3]，侗族有每年三月三利用烏飯樹汁染色米飯食用的歷史。民國時期用南燭葉染色制成的黑官膳，更是名噪一時。如今烏飯菜肴依舊有跡可循，在江蘇無錫就有專門烏米飯產(chǎn)品。很多學(xué)者也對其進行了研究探索[4]，發(fā)現(xiàn)其葉的提取物具有很好的抑菌[5-9]、降糖[10]、抗氧化[11-16]、抗疲勞[17-18]等效果。在食品生產(chǎn)過程中，為保證品質(zhì)及增加其耐儲藏性，常在食品中應(yīng)用如苯甲酸、山梨酸及其鹽類等的化學(xué)防腐劑，這雖然能起到一定的防腐抑菌效果，但其在食品中的用量受到嚴格的限制。且隨著廣大消費者對食品質(zhì)量安全的高度關(guān)注，天然防腐劑以其更高的安全性逐漸受到青睞[19]。因此，從南燭葉中開發(fā)出一種天然抑菌劑，具有非常高的研究價值。

近年來，章海燕等[20-21]研究發(fā)現(xiàn)，南燭葉水提粗黃酮的抑菌效果強于山梨酸鉀的抑菌效果，且在研究南燭葉不同提取物的抑菌作用時，發(fā)現(xiàn)南燭葉乙醇浸提物比水浸提物抑菌效果更明顯；李艷麗等[22]的研究表明，南燭葉乙醇提取液可顯著延長饅頭、面條等的保質(zhì)期，效果與化學(xué)防腐劑基本相當。但從已有的文獻資料來看，大多從南燭葉不同提取條件、不同菌種、不同提取物來比較南燭葉抑菌差異，鮮見不同狀態(tài)下的南燭葉抑菌效果的比較研究。因此，本研究在相同提取條件下用無菌水分別浸提新鮮南燭葉和南燭葉干粉，比較研究二者水提物對5種供試細菌及6種供試真菌的抑制作用，以期為天然抑菌劑的深度開發(fā)及利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與菌種

新鮮南燭葉（水分含量為61.64%，總黃酮含量24.4312mg/g干物質(zhì)）：采自安徽省宣城市宣州區(qū)沈村鎮(zhèn)郊區(qū)的山上的南燭灌木；南燭葉干粉（水分含量為6.51%，總黃酮含量11.881 2 mg/g干物質(zhì)）：安徽省宣城市森林之寶農(nóng)林開發(fā)有限公司。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、沙門氏菌（Salmonella）、啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、紅酵母（Rhodotorula）、黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、毛霉（Mucor）、根霉（Rhizopus）：均由本校食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院菌種保藏中心提供；生理鹽水（0.85%）：實驗室自行配制。

1.1.2 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，pH自然。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯300 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15 g/L，pH自然。

平板計數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）培養(yǎng)基：胰蛋白胨5.0 g/L，酵母膏粉2.5 g/L，葡萄糖1.0 g/L，瓊脂15.0 g/L，pH自然。

1.2 儀器與設(shè)備

SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水真空泵：邦西儀器科技（上海）有限公司；2代XY-100型高速多功能粉碎機：浙江省永康市松青五金廠；722N可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；PHS-25 pH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；DK-98-IIA恒溫水浴鍋、101-2AB型電熱鼓風干燥箱、SPX-250BⅢ生化培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司；LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；不銹鋼小管（內(nèi)徑6 mm、外徑8 mm牛津杯）：上海申源科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 新鮮南燭葉及南燭葉干粉水提物的制備[23]

準確稱取經(jīng)高速多功能粉碎機粉碎的新鮮南燭葉粉末和南燭葉干粉，使其分別含南燭葉干物質(zhì)10 g，置于燒杯中并分別加入適量無菌水，使其干物質(zhì)與水質(zhì)量之比為1∶20（g∶mL），均調(diào)節(jié)至pH=4.0。同時放入80 ℃恒溫水浴鍋中提取2 h后抽濾，分別取其濾液并濃縮至10 mL，得到新鮮南燭葉和南燭葉干粉水提物原液，同時置于121℃條件下滅菌20 min，備用。

1.3.2 供試菌懸液的制備[24-27]

在超潔凈工作臺上，取活化好的菌種，每種供試細菌用接種環(huán)挑取一環(huán)于100 mL盛有玻璃珠的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃搖床200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。使用無菌移液槍分別移取1 mL已培養(yǎng)24 h的細菌菌懸液，置于盛有玻璃珠的100 mL無菌生理鹽水中；每種供試真菌用接種環(huán)挑取5環(huán)置于盛有玻璃珠的100mL無菌生理鹽水中。細菌、真菌生理鹽水混合液分別于37℃、28℃搖床200 r/min振蕩培養(yǎng)2 h，調(diào)節(jié)其菌液濃度為1×106CFU/mL，制成供試菌懸液。

1.3.3 濾紙圓片法測定[28-29]

用打孔器制成6 mm直徑的圓濾紙片，滅菌后備用。采用浸泡法將等量濾紙片分別放入上述制備的新鮮南燭葉、南燭葉干粉水提物以及滅菌生理鹽水中，置于200 r/min搖床振蕩2 h，使濾紙片充分吸收水提物、生理鹽水至飽和。

在無菌操作條件下，用無菌移液槍移取0.1 mL供試菌懸液于制備好的平板培養(yǎng)基上，用涂布器將菌液涂布均勻，放置片刻。將浸泡好的濾紙片裝入無菌平皿，方便夾取。用已滅菌的鑷子夾取濾紙片，在平皿壁上瀝去多余浸泡液，輕輕放置于培養(yǎng)基平板表面，每個平板等距放入5張濾紙片，其中4張為浸有水提物的濾紙片，1張為浸有無菌生理鹽水的濾紙片作對照。細菌于37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)24 h，霉菌及酵母于28℃倒置培養(yǎng)48 h。每一種菌做3次重復(fù)試驗，記錄并計算每個重復(fù)試驗的數(shù)據(jù)及平均值。

1.3.4 牛津杯法測定[30-31]

在無菌操作條件下，用無菌移液槍移取0.1 mL供試菌懸液于制備好的平板培養(yǎng)基上，用涂布器將菌液涂布均勻，放置片刻，用無菌鑷子夾取已滅菌的牛津杯平置于平板表面，輕輕按壓使每個牛津杯杯底與平板連接緊湊，每個平板等距放入3個牛津杯，其中兩個牛津杯用移液槍分別加入0.25 mL無菌新鮮南燭葉水提物，另一個牛津杯加入0.25mL無菌生理鹽水作對照。將平板正置于恒溫培養(yǎng)箱中，細菌37℃培養(yǎng)24 h，霉菌及酵母28℃培養(yǎng)48 h。每一種菌做3次重復(fù)試驗，分別測量各個抑菌圈的兩個垂直直徑大小，計算每個重復(fù)試驗的平均值。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

上述數(shù)據(jù)均采用3次平行樣，采用平均值±標準差計算，統(tǒng)計方差分析方法見文獻。

2 結(jié)果與分析

2.1 新鮮南燭葉與南燭葉干粉水提物濾紙圓片法抑菌效果

新鮮南燭葉與南燭葉干粉水提物濾紙圓片法抑菌試驗結(jié)果見表1。

由表1可知，根據(jù)抑菌圈直徑明顯＞6 mm有抑菌性，南燭葉干粉與新鮮南燭葉水提物均對5種試驗細菌有抑菌作用，但對6種試驗霉菌及酵母無明顯抑菌效果。南燭葉干粉水提物對金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌的平均抑菌圈直徑分別為11.38 mm、8.97mm、9.63mm、10.09mm、8.31mm。對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑制活性極顯著優(yōu)于新鮮南燭葉（P＜0.01）；而對大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌的抑菌效果與新鮮南燭葉相差不大?？赡芘c濾紙圓片法操作簡單，步驟便捷，但水提物浸泡濾紙片法濾紙片所吸收的藥液量不好控制，易造成試驗誤差[32]，不適于進行定量試驗有關(guān)[33]。

表1 兩種水提物對11種供試菌的濾紙圓片法抑菌效果（x±s，n=12）Table 1 Antibacterial effect of two aqueous extract against 11 tested microbes by filter paper method(x±s，n=12)

2.3 新鮮南燭葉與南燭葉干粉水提物牛津杯法抑菌效果

新鮮南燭葉與南燭葉干粉水提物牛津杯法抑菌試驗結(jié)果見表2。

表2 兩種水提物對11種供試菌牛津杯法抑菌效果（x±s，n=6）Table 2 Antibacterial effect of two aqueous extract against 11 tested microbes by Oxford cup method(x±s，n=6)

由表2可知，根據(jù)抑菌圈直徑明顯大于8 mm有抑菌性，本結(jié)果中兩種南燭葉水提物均對5種供試細菌都有抑制作用，但對6種試驗霉菌及酵母無明顯抑菌效果。南燭葉干粉水提物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌的平均抑菌圈直徑分別達28.25 mm、16.42 mm、16.25 mm、13.69 mm，均極顯著優(yōu)于新鮮南燭葉（P＜0.01），對蠟樣芽孢桿菌的平均抑菌圈直徑為14.75 mm，顯著優(yōu)于新鮮南燭葉（P＜0.05）。金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌圈結(jié)果表明，兩種水提物均對革蘭氏陽性菌作用相對較強；沙門氏菌的抑菌圈結(jié)果顯示，兩種水提物對革蘭氏陰性菌的抑菌作用相對較弱。這可能與革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的細胞壁的結(jié)構(gòu)層次、組成成分有關(guān)。革蘭氏陰性菌的細胞壁結(jié)構(gòu)層次與成分較為復(fù)雜。而革蘭氏陽性菌的細胞壁則主要由磷壁酸和肽聚糖組成，層次單一，成分較為簡單[34]。這使得革蘭氏陽性菌對理化因子的敏感性強于革蘭氏陰性菌[35]。

本試驗顯示，南燭葉干粉水提物及新鮮南燭葉水提物對5種被測細菌的抑菌圈大小均呈現(xiàn)出金黃色葡萄球菌＞枯草芽孢桿菌＞大腸桿菌＞蠟樣芽孢桿菌＞沙門氏菌。李艷麗等[22]研究表明，在牛津杯法測試中，南燭葉乙醇提取物對測試細菌均有抑菌效果，且同種南燭葉水提物對金黃色葡萄球菌的抑菌抑菌圈直徑大于大腸桿菌抑菌直徑，這與本試驗的結(jié)果一致。但其結(jié)果還顯示，牛津杯法測試中南燭葉乙醇提取物對毛霉、曲霉均有明顯抑菌效果，這與本試驗的結(jié)果不一致。原因可能是其南燭葉提取采用乙醇為溶劑，在抑菌試驗中其乙醇并未脫除，致使南燭葉醇提物對毛霉、曲霉的抑菌活性物質(zhì)來源于具有一定殺菌功效的乙醇。

2.4 討論

在本研究中南燭葉干粉水提物對同種測試細菌的抑制效果優(yōu)于新鮮南燭葉水提物，根據(jù)王立等[36]研究的南燭葉提取物主要成分為總糖約為52.1%，黃酮約為20.6%，蛋白質(zhì)約為3.08%，脂肪約為0.9%，表明南燭葉提取物中總糖的含量遠高于黃酮含量。章海燕等[21]研究的南燭葉水浸提物、乙醇浸提物及粗多糖在相同條件下對大腸桿菌的最低抑菌濃度分別為15.30mg/mL、3.5750mg/mL、13.135mg/mL，表明南燭葉提取物中的粗多糖也具有很好的抑菌效果，且南燭葉粗多糖對大腸桿菌的抑菌效果優(yōu)于水浸提物。楊冬梅等[37]研究的干香菇干物質(zhì)提取的粗多糖為11.79 mg/g，而鮮香菇僅為5.37mg/mL，且在同種菌的抑制作用上，干香菇粗提物要優(yōu)于鮮香菇粗提物。推測南燭葉干粉水提物中的粗多糖含量高于新鮮南燭葉水提物，其與黃酮的共同作用致使南燭葉干粉水提物對同種測試細菌的抑制效果優(yōu)于新鮮南燭葉水提物，但其中的機理還有待于進一步研究考察。

3 結(jié)論

本研究采用濾紙圓片法和牛津杯法對兩種南燭葉水提物對11種受試菌的抑菌效果進行了比較研究。結(jié)果表明，兩種水提物均對被測霉菌及酵母無明顯抑菌效果，均對被測細菌有顯著的抑制作用。牛津杯法定量試驗結(jié)果更佳，南燭葉干粉水提物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌的平均抑菌圈直徑分別達28.25 mm、16.42 mm、16.25 mm、13.69 mm，均極顯著優(yōu)于新鮮南燭葉（P＜0.01），對蠟樣芽孢桿菌的平均抑菌圈直徑為14.75mm，顯著優(yōu)于新鮮南燭葉（P＜0.05）。

本實驗首次將新鮮南燭葉與南燭葉干粉水提物抑菌效果比較作為研究對象，為創(chuàng)新型植物源抑菌劑開辟了一條新途徑。而對于南燭葉的抑菌機理、抑菌活性物質(zhì)成分及含量、量效關(guān)系等方面還有待于更進一步的探討探究。