余雪鋒，耿文敬，郭肖穎，朱 江

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，合肥 230036；2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程研究所，合肥 230031）

氯氰菊酯（Cypermethrin，CPM），是繼有機(jī)磷、有機(jī)氯等農(nóng)藥之后發(fā)展起來(lái)的一類新型殺蟲(chóng)劑，被廣泛應(yīng)用于棉花、蔬菜、大豆和甜菜等作物害蟲(chóng)的防治[1]。順式氯氰菊酯（α-CPM）和高效氯氰菊酯（β-CPM）具有殺蟲(chóng)譜廣、殺蟲(chóng)效率高、生產(chǎn)成本低和工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，是擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑中應(yīng)用范圍廣、使用量大的菊酯類農(nóng)藥[2-3]。

CPM環(huán)境穩(wěn)定性強(qiáng)，不易被光和空氣降解。世界衛(wèi)生組織將CPM定性為中等毒性，歐盟規(guī)定水產(chǎn)品中 CPM 最高殘留量為 50 μg·kg-1[4]。Kumari等[5]在印度的棉花-小麥和水稻-小麥輪作田地和甘蔗地檢測(cè)到CPM殘留量為1～35μg·kg-1。宋國(guó)春等[6]研究發(fā)現(xiàn)青花菜中CPM殘留量為0.160～0.397 mg·kg-1。余正萍[7]測(cè)定出CPM在四川黃瓜山果園摘取的黃桃、名豪超市購(gòu)買的梨和永川重百超市購(gòu)買的蘋果殘留量為0.009 0～0.017 9 mg·L-1。CPM殘留可通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，危害人體健康[8]。

CPM已被美國(guó)環(huán)境保護(hù)局（U.S.Environmental Protection Agency，USEPA）認(rèn)定為可疑致癌物[9]。有研究顯示，CPM暴露可誘導(dǎo)機(jī)體的生殖毒性[4]。Undeger等[10]研究表明200 g·L-1的CPM顯著增加人體淋巴細(xì)胞DNA損傷。馬萍等[11]研究發(fā)現(xiàn)β-CPM（≥20 mg·kg-1）造成小鼠神經(jīng)細(xì)胞DNA和腦組織氧化損傷，且有劑量效應(yīng)。阮秦莉等[12]研究發(fā)現(xiàn)將L4期野生型秀麗隱桿線蟲(chóng)暴露于8.0 mg·L-1的CPM 48 h后產(chǎn)卵數(shù)目明顯降低。Wang等[13]研究表明哺乳期小鼠母體暴露于6.25 mg·kg-1的CPM可導(dǎo)致雄性子代睪丸發(fā)育和精子發(fā)生長(zhǎng)期損害。目前，CPM對(duì)機(jī)體生殖損傷的相關(guān)作用機(jī)理鮮有報(bào)道，尤其關(guān)于CPM作用于機(jī)體生殖毒性損傷信號(hào)傳導(dǎo)途徑的研究幾乎尚未涉及。基于此，本文以秀麗隱桿線蟲(chóng)作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以線蟲(chóng)生殖細(xì)胞凋亡、產(chǎn)卵量和卵孵化率作為生物檢測(cè)終點(diǎn)，開(kāi)展兩種常用氯氰菊酯α-CPM和β-CPM作用于機(jī)體的生殖毒性效應(yīng)，并探索生殖損傷發(fā)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，探討相關(guān)作用機(jī)理，為評(píng)估α-CPM和β-CPM暴露的健康危害性提供理論研究數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 線蟲(chóng)品系與培養(yǎng)

N2 Brisitol野生型。

ced-3（mt1522）、ced-4（mt2547），屬于 caspase缺失，缺乏生理性細(xì)胞凋亡和遺傳性誘導(dǎo)的生殖細(xì)胞凋亡。

cep-1（jr1279），為p53基因突變，具有生理性細(xì)胞凋亡。

hus-1（ws2277）為DNA損傷響應(yīng)基因突變，具有生理性的生殖細(xì)胞凋亡，但缺乏誘導(dǎo)輻射的細(xì)胞凋亡和生殖細(xì)胞周期停滯。

lin45（mh575）、mek-2（mt8666）、mpk（mh37）均為ERK MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的成員。

mkk（cz4213）、jnk（vc8）、jkk（ku2）、mek-1（fk141）均為JNK MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的成員。

nsy-1（au3）、sek-1（au1）、pmk（ku25）均 為 p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的成員。

以上所有線蟲(chóng)品系均由美國(guó)NIH資助的國(guó)際線蟲(chóng)種質(zhì)中心（CGC）贈(zèng)送。將線蟲(chóng)培養(yǎng)于含有大腸桿菌OP50的NGM平板固體培養(yǎng)基（Nematode Growth Medium）上，20℃恒溫培養(yǎng)[14]。按照Donkin等[15]的方法同步化，獲得大量L4期線蟲(chóng)。

1.2 主要試劑

α-CPM（順式氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品）：CAS NO：[67375-30-8]，產(chǎn)品貨號(hào)：ZDR-C11890100，中文名：alpha-氯氰菊酯，英文名：alpha-Cypermethrin，規(guī)格：0.1 g。分子量為416.30，難溶于水，在醇類、酮類和取代芳烴類有機(jī)溶劑中溶解＞450 g·L-1。

β-CPM（高效氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品）：CAS NO：[72204-43-4]，產(chǎn)品貨號(hào)：ZDR-C11890200，中文名：beta-氯氰菊酯，英文名：beta-Cypermethrin，規(guī)格：0.1 g。分子量為416.30，難溶于水，在醇類、酮類和取代芳烴類有機(jī)溶劑中溶解＞450 g·L-1。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 CPM毒性暴露試驗(yàn)

CPM殺蟲(chóng)劑難溶于水，易溶于有機(jī)溶劑。實(shí)驗(yàn)以純丙酮溶液作為溶劑，將CPM配制成0.1 g·mL-1的母液。暴露溶液由母液以K-medium為溶劑梯度稀釋至 0.005、0.05、0.2、0.8、3.2 mg·L-1濃度，以 K-medium溶液作對(duì)照。將L4期線蟲(chóng)接入到不同濃度CPM溶液的Costar 12孔組織培養(yǎng)板，加入2%E.coli OP50濃縮菌作為食物，配制成1 mL的培養(yǎng)液，置于20℃恒溫?fù)u床，在24 h后將處理后的線蟲(chóng)取出進(jìn)行進(jìn)一步分析。

文章應(yīng)用線蟲(chóng)生殖細(xì)胞死亡、產(chǎn)卵量和卵孵化率作為生物檢測(cè)終點(diǎn)，研究α-CPM和β-CPM暴露對(duì)機(jī)體生殖發(fā)育的影響。將同步化的L4期線蟲(chóng)或早期成蟲(chóng)暴露于0.005、0.05、0.2、0.8、3.2 mg·L-1的α-CPM和β-CPM染毒培養(yǎng)24 h后，統(tǒng)計(jì)其生殖腺的死亡細(xì)胞數(shù)目、產(chǎn)卵量和卵孵化率。各對(duì)照組、暴露組的測(cè)定數(shù)目為15～20條線蟲(chóng)。

0.005 、0.05、0.2、0.8、3.2 mg·L-1的CPM處理液中的丙酮濃度分別為：0.025、0.25、1、4、16 μL·mL-1，與K-medium對(duì)照相比均未出現(xiàn)顯著性差異（圖1），所以以丙酮為溶劑的CPM處理液中丙酮的濃度不影響線蟲(chóng)生殖細(xì)胞凋亡的評(píng)價(jià)結(jié)果。

圖1 丙酮暴露誘導(dǎo)的線蟲(chóng)生殖細(xì)胞死亡Figure 1 Acetone induced germ cells death in C.elegans

1.3.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用IBM SPSS Statistics 19.0分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，以Turkey多重比較檢驗(yàn)不同濃度的α-CPM和β-CPM暴露對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)生殖發(fā)育的影響。利用雙尾t檢驗(yàn)同一品系線蟲(chóng)α-CPM和β-CPM不同暴露濃度所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡、產(chǎn)卵量和卵孵化率的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-CPM和β-CPM暴露誘導(dǎo)線蟲(chóng)的生殖細(xì)胞死亡

圖2結(jié)果顯示，暴露于α-CPM的線蟲(chóng)生殖細(xì)胞死亡數(shù)目在0.005～0.2 mg·L-1范圍內(nèi)呈遞增趨勢(shì)，在0.05 mg·L-1已表現(xiàn)出顯著性差異（P＜0.05），并于0.2 mg·L-1達(dá)到最大值，而當(dāng)α-CPM濃度增加至0.2～3.2 mg·L-1范圍時(shí)，線蟲(chóng)生殖細(xì)胞死亡數(shù)目與0.2 mg·L-1暴露組相比呈先減少后增加的趨勢(shì)，且與對(duì)照相比均出現(xiàn)顯著性差異。暴露于β-CPM的線蟲(chóng)生殖細(xì)胞死亡數(shù)目的變化趨勢(shì)與α-CPM基本一致。正常生長(zhǎng)發(fā)育的線蟲(chóng)，其生殖腺有絲分裂區(qū)的細(xì)胞排列緊致有序，細(xì)胞核大小均勻，而隨著α-CPM和β-CPM暴露濃度的增加，這種有序的結(jié)構(gòu)逐漸被破壞，且細(xì)胞數(shù)量明顯減少（圖3）。暴露于β-CPM的線蟲(chóng)生殖細(xì)胞死亡數(shù)目與對(duì)照相比出現(xiàn)顯著性差異的濃度為0.005 mg·L-1。這一結(jié)果說(shuō)明，以線蟲(chóng)生殖細(xì)胞凋亡為檢測(cè)終點(diǎn)時(shí)，β-CPM暴露誘導(dǎo)顯著性生殖細(xì)胞死亡的濃度低于α-CPM，即β-CPM暴露對(duì)機(jī)體造成的生殖毒性較α-CPM大。

圖2 α-CPM和β-CPM誘導(dǎo)的線蟲(chóng)生殖細(xì)胞死亡Figure 2 α-CPM and β-CPM induced germ cells death in C.elegans

較低濃度的α-CPM和β-CPM暴露均誘導(dǎo)線蟲(chóng)發(fā)生顯著的生殖細(xì)胞凋亡，并于0.2 mg·L-1暴露濃度達(dá)到最大值，故在之后探究相關(guān)作用機(jī)理中，均選用0.2 mg·L-1作為供試濃度。

2.2 α-CPM和β-CPM暴露誘導(dǎo)的線蟲(chóng)生殖細(xì)胞死亡依賴核心凋亡途徑

線蟲(chóng)中，ced-3和ced-4是生殖細(xì)胞凋亡的核心調(diào)控基因，為明確α-CPM和β-CPM暴露誘導(dǎo)線蟲(chóng)生殖細(xì)胞死亡是細(xì)胞壞死還是程序性的細(xì)胞凋亡，凋亡的細(xì)胞呈亮黃色，是DNA片斷化的一個(gè)重要標(biāo)志，而未凋亡的細(xì)胞呈現(xiàn)均勻的淺綠色（圖4），將ced-3和ced-4基因缺陷型的線蟲(chóng)品系ced-3（mt1522）和ced-4（mt2547）暴露于0.2 mg·L-1的α-CPM和β-CPM進(jìn)行染毒處理。圖5結(jié)果顯示，暴露于0.2 mg·L-1的α-CPM和β-CPM的ced-3（mt1522）和ced-4（mt2547）線蟲(chóng)，其單個(gè)生殖腺臂的生殖細(xì)胞死亡數(shù)目與對(duì)照相比無(wú)顯著性差異，而以0.2 mg·L-1的α-CPM和β-CPM處理的野生型N2線蟲(chóng)品系，其單個(gè)生殖腺臂的細(xì)胞死亡數(shù)目從對(duì)照的2.05±0.17分別增加至3.67±0.27和3.76±0.27（P＜0.01）。由于ced-3和ced-4基因是細(xì)胞凋亡所必需的，而α-CPM和β-CPM暴露不能使ced-3（mt1522）和ced-4（mt2547）基因缺陷型品系的AO陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目增加，表明在野生型N2線蟲(chóng)品系上所檢測(cè)的AO陽(yáng)性細(xì)胞是凋亡細(xì)胞（圖5，P＞0.05）。且ced-3突變品系線蟲(chóng)為caspase基因突變，缺乏caspase途徑會(huì)抑制生理性的生殖細(xì)胞凋亡，表明α-CPM和β-CPM誘導(dǎo)的生殖細(xì)胞死亡是依賴于ced-3和ced-4基因調(diào)控的細(xì)胞凋亡。

圖3 CPM暴露誘導(dǎo)的線蟲(chóng)生殖腺有絲分裂細(xì)胞減少Figure 3 Decreased mitotic germline cells induced by CPM exposure in C.elegans

圖4 CPM誘導(dǎo)的線蟲(chóng)細(xì)胞凋亡>Figure 4 CPM-induced germline apoptosis in C.elegans

圖5 α-CPM和β-CPM誘導(dǎo)的線蟲(chóng)生殖細(xì)胞死亡依賴ced-3和ced-4基因的表達(dá)Figure 5 α-CPM and β-CPM-induced germ cell death dependent of ced-3 and ced-4 genes in C.elegans

2.3 α-CPM和β-CPM暴露誘導(dǎo)的線蟲(chóng)生殖細(xì)胞凋亡不依賴DNA損傷信號(hào)通路

為研究α-CPM和β-CPM誘導(dǎo)的生殖細(xì)胞凋亡的途徑，將基因缺陷型品系cep-1（jr1279）暴露于0.2 mg·L-1的α-CPM和β-CPM進(jìn)行染毒處理，24 h后測(cè)定其生殖細(xì)胞凋亡數(shù)目。圖6結(jié)果顯示，暴露于0.2 mg·L-1的α-CPM和 β-CPM 的 cep-1（jr1279）線蟲(chóng)品系，其生殖細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)目從對(duì)照的2.52±0.19分別增加至4.00±0.27和3.90±0.22，其增長(zhǎng)趨勢(shì)與α-CPM和β-CPM染毒處理的野生型N2基本一致（P＜0.05），這一研究結(jié)果說(shuō)明，cep-1基因的功能缺失不影響α-CPM和β-CPM誘導(dǎo)的線蟲(chóng)生殖細(xì)胞凋亡，即α-CPM和β-CPM誘導(dǎo)的線蟲(chóng)生殖細(xì)胞凋亡不依賴于cep-1的表達(dá)。

圖6 DNA損傷檢測(cè)點(diǎn)蛋白HUS-1和響應(yīng)基因cep-1在α-CPM和β-CPM誘導(dǎo)的生殖細(xì)胞凋亡中的作用Figure 6 Roles of checkpoint protein HUS-1 and DDR gene cep-1 in α-CPM and β-CPM-induced germ cell apoptosis

為了研究hus-1基因是否參與調(diào)節(jié)α-CPM和β-CPM誘導(dǎo)的生殖細(xì)胞凋亡，將基因缺陷型品系hus-1（ws2277）暴露于0.2 mg·L-1的α-CPM和β-CPM進(jìn)行染毒處理，24 h后線蟲(chóng)生殖細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著增加（P＜0.01），圖6結(jié)果顯示，hus-1基因未參與α-CPM和β-CPM誘導(dǎo)的生殖細(xì)胞凋亡。綜合上述研究結(jié)果說(shuō)明，α-CPM和β-CPM誘導(dǎo)的線蟲(chóng)生殖細(xì)胞凋亡不依賴DNA損傷信號(hào)通路。

2.4 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在α-CPM和β-CPM誘導(dǎo)的生殖細(xì)胞凋亡中的作用

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-actived protein kinase，MAPK）是真核生物信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一，在基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞質(zhì)功能活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。MAPK有3個(gè)主要家族：ERK、JNK和p38 MAPK。文章探索了MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在α-CPM和β-CPM誘導(dǎo)的生殖細(xì)胞凋亡中的作用。

2.4.1 α-CPM和β-CPM誘導(dǎo)的線蟲(chóng)生殖細(xì)胞凋亡不依賴ERK MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

在C.elegans中，ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑成員有l(wèi)in-45（MAPKKK），mek-2（MAPKK）和 mpk-1（MAPK）。將基因敲除的線蟲(chóng)品系lin-45（mh575）、mek-2（mt8666）以及mpk-1（mh37）分別暴露于0.2 mg·L-1的α-CPM和β-CPM進(jìn)行染毒處理，圖7結(jié)果顯示，lin-45（mh575）、mek-2（mt8666）以及 mpk-1（mh37）的生理性細(xì)胞凋亡數(shù)目分別為3.90±0.22、4.58±0.27、3.47±0.25，暴露于0.2 mg·L-1的α-CPM染毒培養(yǎng)24 h后，其細(xì)胞凋亡數(shù)目分別為 5.13±0.27、5.67±0.25、4.70±0.32，相對(duì)值分別為1.23、1.09、1.23，均出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.01）；暴露于0.2 mg·L-1的β-CPM染毒培養(yǎng)24 h后，其細(xì)胞凋亡數(shù)目分別為5.21±0.34、6.35±0.31、4.55±0.28，相對(duì)值分別為1.31、1.77、1.08，與未處理的自身對(duì)照相比亦出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.01）。比較暴露于α-CPM和β-CPM的野生型N2與lin-45（mh575）、mek-2（mt8666）以及 mpk-1（mh37）的相對(duì)值發(fā)現(xiàn)，lin-45（mh575）、mek-2（mt8666）以及mpk-1（mh37）增加的幅度基本與野生型N2一致，說(shuō)明ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因的突變并未阻止α-CPM和β-CPM誘導(dǎo)的生殖細(xì)胞凋亡，也就是說(shuō)ERK MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑不是α-CPM和β-CPM誘導(dǎo)線蟲(chóng)生殖細(xì)胞凋亡的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

圖7 ERK MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在α-CPM和β-CPM誘導(dǎo)的線蟲(chóng)生殖細(xì)胞凋亡中的作用Figure 7 Roles of ERK MAPK signaling pathways in α-CPM and β-CPM-induced germ cell apoptosis

2.4.2 α-CPM和β-CPM誘導(dǎo)的線蟲(chóng)生殖細(xì)胞凋亡依賴JNK MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

在C.elegans中，JKK-1屬于JNK MAPK，MKK-4則是其激活蛋白。MKK-4在線蟲(chóng)中有2個(gè)同源蛋白，分別為JKK-1和MEK-1。這些基因的缺失會(huì)使C.elegans對(duì)環(huán)境的脅迫敏感，如重金屬暴露和饑餓。將基因缺陷型品系 mek-1（fk171）、jnk-1（vc8）、jkk-1（ku2）和mkk-4（cz4213）暴露于0.2 mg·L-1的α-CPM和β-CPM染毒處理24 h后觀察其生殖細(xì)胞的凋亡數(shù)目。圖8結(jié)果顯示，mek-1（fk171）、jnk-1（vc8）、jkk-1（ku2）和mkk-4（cz4213）品系中生殖細(xì)胞凋亡數(shù)目分別為3.52±0.26、3.21±0.18、4.42±0.29個(gè)和4.42±0.29個(gè)，暴露于0.2 mg·L-1的α-CPM染毒培養(yǎng)24 h后，其細(xì)胞凋亡數(shù)目分別為2.60±0.17、3.05±0.20、4.52±0.25個(gè)和 4.52±0.25 個(gè)，jnk-1（vc8）、jkk-1（ku2）和mkk-4（cz4213）品系線蟲(chóng)與自身未處理對(duì)照相比均未達(dá)到顯著性差異（P＞0.05）；暴露于0.2 mg·L-1的β-CPM染毒培養(yǎng)24 h后，mek-1（fk171）、jnk-1（vc8）、jkk-1（ku2）和mkk-4（cz4213）品系中生殖細(xì)胞凋亡數(shù)目分別為3.35±0.26、2.63±0.17、4.83±0.29個(gè)和 4.83±0.29個(gè)，mek-1（fk171）、jkk-1（ku2）和 mkk-4（cz4213）與自身未處理對(duì)照相比均未達(dá)到顯著性差異（P＞0.05）。上述研究結(jié)果表明，JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是α-CPM和β-CPM誘導(dǎo)生殖細(xì)胞凋亡所需要的。

圖8 JNK MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在α-CPM和β-CPM誘導(dǎo)的線蟲(chóng)生殖細(xì)胞凋亡中的作用Figure 8 Roles of ERK MAPK signaling pathways in α-CPM and β-CPM-induced germ cell apoptosis

2.4.3 α-CPM和β-CPM誘導(dǎo)的線蟲(chóng)生殖細(xì)胞凋亡部分依賴p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

在C.elegans中，nsy-1編碼MAPKKK、SEK-1是MAPKK家族，以及PMK-1是p38 MAPK家族成員之一。將基因敲除品系nsy-1（au3）、sek-1（au1）和pmk（ku25）暴露于0.2 mg·L-1的a-CPM和β-CPM染毒培養(yǎng)24 h，圖9結(jié)果顯示，暴露于0.2 mg·L-1的α-CPM的nsy-1（au3）和sek-1（au1）線蟲(chóng)品系，其生殖細(xì)胞凋亡數(shù)目分別由2.62±0.26和2.75±0.19上升至3.89±0.29和3.48±0.29（P＜0.05），而在pmk（ku25）品系中，其生殖細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著降低（P＜0.05）；暴露于β-CPM的nsy-1（au3）、sek-1（au1）和pmk（ku25）的生殖細(xì)胞凋亡數(shù)目變化趨勢(shì)與α-CPM基本一致。綜合上述研究結(jié)果說(shuō)明，nsy-1和sek-1基因的缺失不影響a-CPM和β-CPM誘導(dǎo)的生殖細(xì)胞凋亡，而pmk基因的功能缺失減少了a-CPM和β-CPM誘導(dǎo)的生殖細(xì)胞凋亡數(shù)目，該研究結(jié)果表明，a-CPM和β-CPM誘導(dǎo)的線蟲(chóng)生殖細(xì)胞凋亡部分依賴p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

2.5 α-CPM和β-CPM暴露對(duì)線蟲(chóng)產(chǎn)卵量和卵孵化率的影響

圖9 p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在α-CPM和β-CPM誘導(dǎo)的線蟲(chóng)生殖細(xì)胞凋亡中的作用Figure 9 Roles of p38 MAPK signaling pathways in α-CPM and β-CPM-induced germ cell apoptosis

當(dāng)前已有研究結(jié)果顯示，CPM暴露可誘導(dǎo)小鼠細(xì)胞周期阻滯及DNA損傷，且在接觸CPM的農(nóng)民的淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了遺傳毒性效應(yīng)。而本文以生殖細(xì)胞凋亡為生物檢測(cè)終點(diǎn)的結(jié)果顯示，α-CPM和β-CPM誘導(dǎo)的生殖細(xì)胞凋亡不依賴DNA損傷信號(hào)通路，為了明確α-CPM和β-CPM暴露是否引起機(jī)體的DNA損傷效應(yīng)，研究了α-CPM和β-CPM暴露對(duì)線蟲(chóng)的產(chǎn)卵量和卵孵化率的影響。

線蟲(chóng)成蟲(chóng)體內(nèi)卵的數(shù)目及產(chǎn)卵量代表線蟲(chóng)生育后代的能力，是線蟲(chóng)生殖發(fā)育的一個(gè)至關(guān)重要的指標(biāo)。將同步化的L4期或早期成蟲(chóng)暴露于0.05、0.2、0.8、3.2 mg·L-1的α-CPM和β-CPM染毒培養(yǎng)24 h后，統(tǒng)計(jì)其產(chǎn)卵數(shù)目和卵孵化率。圖10A結(jié)果顯示，暴露于α-CPM的線蟲(chóng)產(chǎn)卵量在0.05～3.2 mg·L-1范圍內(nèi)呈遞減趨勢(shì)（P＜0.01），具有劑量效應(yīng)。暴露于β-CPM的線蟲(chóng)產(chǎn)卵量的變化趨勢(shì)與α-CPM基本一致（P＜0.01）。圖10B結(jié)果顯示，暴露于α-CPM的線蟲(chóng)卵孵化率在0.05～3.2 mg·L-1范圍內(nèi)呈遞減趨勢(shì)（P＜0.05），具有劑量效應(yīng)。暴露于β-CPM的線蟲(chóng)卵孵化率的變化趨勢(shì)與α-CPM基本一致（P＜0.01）。比較野生型N2 α-CPM和β-CPM產(chǎn)卵量和卵孵化率的相對(duì)值發(fā)現(xiàn)，β-CPM暴露誘導(dǎo)線蟲(chóng)產(chǎn)卵量和卵孵化率的下降幅度較α-CPM大，且在0.05 mg·L-1的β-CPM的線蟲(chóng)卵孵化率已表現(xiàn)出極顯著性差異（P＜0.01）。上述結(jié)果說(shuō)明，α-CPM和β-CPM的暴露誘導(dǎo)線蟲(chóng)生殖腺受損，意味著造成機(jī)體的DNA損傷，提示它對(duì)線蟲(chóng)生殖細(xì)胞可能具有遺傳毒性作用，β-CPM暴露對(duì)機(jī)體造成的生殖毒性較α-CPM大，與凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。α-CPM和β-CPM暴露誘導(dǎo)線蟲(chóng)DNA損傷的具體作用機(jī)理是未來(lái)研究的主要方向。

圖10 不同濃度α-CPM和β-CPM對(duì)線蟲(chóng)產(chǎn)卵量和卵孵化率的影響Figure 10 The effect of different concentration α-CPM and β-CPM on brood size and hatching rate in C.elegans

3 討論

文獻(xiàn)顯示，線蟲(chóng)生殖細(xì)胞凋亡對(duì)外界環(huán)境壓力非常敏感，已被應(yīng)用于重金屬、輻射等環(huán)境健康的評(píng)價(jià)[16]。線蟲(chóng)的子代數(shù)目和卵孵化率反映其繁殖能力，亦是機(jī)體響應(yīng)環(huán)境脅迫引起生殖損傷的重要指標(biāo)。本文以線蟲(chóng)的生殖細(xì)胞凋亡、產(chǎn)卵量和卵孵化率作為生物檢測(cè)終點(diǎn)，0.05 mg·L-1的α-CPM和β-CPM暴露均誘導(dǎo)線蟲(chóng)發(fā)生顯著的生殖細(xì)胞凋亡，在0.005～0.2 mg·L-1范圍內(nèi)較對(duì)照組呈遞增趨勢(shì)，暴露于0.8 mg·L-1的α-CPM和β-CPM的線蟲(chóng)生殖細(xì)胞死亡數(shù)目低于暴露于0.2 mg·L-1濃度組，而在0.8～3.2 mg·L-1范圍內(nèi)較0.8 mg·L-1濃度組呈遞增趨勢(shì)。線蟲(chóng)生殖細(xì)胞死亡數(shù)目取決于生殖腺有絲分裂區(qū)的細(xì)胞數(shù)量，并隨著線蟲(chóng)生殖腺有絲分裂區(qū)細(xì)胞數(shù)的減少而減少[17]，暴露于0.2～0.8 mg·L-1范圍內(nèi)的線蟲(chóng)，其生殖細(xì)胞凋亡與0.2 mg·L-1濃度組相比呈減少趨勢(shì)可能與α-CPM和β-CPM暴露誘導(dǎo)的有絲分裂生殖細(xì)胞數(shù)量減少有關(guān)[18]。

在C.elegans中，CEP-1是哺乳動(dòng)物腫瘤抑制基因p53的同源蛋白，具有促進(jìn)DNA損傷引起的細(xì)胞凋亡的功能[19]。在遺傳損傷條件下，線蟲(chóng)生殖細(xì)胞凋亡需要DNA損傷響應(yīng)cep-1的表達(dá)[20]。HUS-1是一個(gè)9∶1∶1的復(fù)合體，編碼了DNA損傷檢測(cè)點(diǎn)蛋白，是DNA損傷的感受因子[21]。檢測(cè)點(diǎn)基因突變阻止了由DNA損傷引起的凋亡，而不影響生理性生殖細(xì)胞凋亡。而本文進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，DNA損傷不是α-CPM和β-CPM暴露誘導(dǎo)線蟲(chóng)生殖細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵信號(hào)通路。而除了DNA依賴性的細(xì)胞凋亡途徑，環(huán)境脅迫還可誘導(dǎo)線蟲(chóng)中非遺傳損傷的凋亡信號(hào)通路。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-actived protein kinase，MAPK）是真核生物信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一，屬于絲氨酸/酸酸蛋白激酶，可被多種刺激所活化[22]。MAPK 有 3個(gè)主要家族：ERK、JNK 和 p38 MAPK，在C.elegans均可找到其同源蛋白，因此，C.elegans亦含有3條主要的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，ERK、JNK和p38 MAPK[23-24]。結(jié)果顯示α-CPM和β-CPM暴露誘導(dǎo)的線蟲(chóng)生殖細(xì)胞凋亡依賴JNK MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，部分依賴p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，而不依賴ERK MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，與低濃度全氟辛烷磺?；淃}（PFOS）處理的線蟲(chóng)作用機(jī)理相似[25]。

產(chǎn)卵孵化的結(jié)果顯示暴露于0.05、0.2、0.8、3.2 mg L-1的α-CPM和β-CPM的線蟲(chóng)產(chǎn)生后代的數(shù)目減少和卵孵化率降低，意味著造成DNA損傷，對(duì)生殖細(xì)胞具有潛在的基因毒性作用，與阮秦莉等[12]研究結(jié)論相一致，具體的作用機(jī)理是未來(lái)研究的主要方向。線蟲(chóng)的性腺可能是α-CPM和β-CPM的靶器官，造成線蟲(chóng)生殖系統(tǒng)發(fā)育和功能異常，并能通過(guò)母體影響子代的發(fā)育[26]。其中暴露于β-CPM的產(chǎn)卵量和卵孵化率下降幅度較大，在一定程度上說(shuō)明β-CPM的生殖毒性更強(qiáng)，與凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。本文研究結(jié)果可以為α-CPM和β-CPM系統(tǒng)地評(píng)估生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供依據(jù)。

4 結(jié)論

（1）α-CPM和β-CPM暴露誘導(dǎo)線蟲(chóng)發(fā)生顯著的生殖細(xì)胞凋亡，且β-CPM生殖毒性較α-CPM大。

（2）α-CPM和β-CPM暴露誘導(dǎo)的線蟲(chóng)生殖細(xì)胞凋亡依賴JNK MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，部分依賴p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

（3）α-CPM和β-CPM暴露誘導(dǎo)線蟲(chóng)產(chǎn)卵量顯著減少和孵化率顯著降低，且β-CPM生殖毒性較α-CPM大。