饒金鵬，邱 楓，蔡益婷，金 帆，金 敏

新建體外受精實驗室顯微注射系統(tǒng)操作改進探究

饒金鵬1，邱 楓1，蔡益婷1，金 帆2，金 敏1

（浙江大學(xué) 醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院體外受精實驗室，浙江 杭州 310052；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，生殖遺傳教育部重點實驗室，浙江 杭州 310006）

針對新建成的體外受精實驗室中顯微注射操作系統(tǒng)不穩(wěn)定，導(dǎo)致卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（ICSI）卵膜刺破效果不佳或過程中損傷卵子紡錘體等問題，對連接了顯微注射針的Eppendorf CellTram vario油壓式手動顯微注射儀的整體通道進行調(diào)整，提高卵子破膜及單精子注射的穩(wěn)定性。通過增加顯微注射儀管道內(nèi)礦物油的更換頻次并調(diào)節(jié)活塞相對位置，保證液壓系統(tǒng)的通暢，通過控制顯微注射針內(nèi)介質(zhì)從針尖至針尾依次為聚乙烯吡咯烷酮、培養(yǎng)油、空氣、礦物油，保證針尖不污染、不堵塞，同時控制回吸、破膜、注射和退針的節(jié)奏，使ICSI操作得以順利實施。經(jīng)過分析及改進，ICSI后卵子退化率顯著下降（<0.05），而受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎形成率以及臨床妊娠率均有所提高。

ICSI；顯微注射針；顯微注射儀；液壓系統(tǒng)；臨床妊娠率

自1978年借助體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer, IVF-ET）技術(shù)誕生第一例“試管嬰兒”路易斯·布朗以來[1]，全世界的試管嬰兒已達數(shù)百萬。作為人口大國的中國，目前不孕癥的發(fā)病率約為15%[2]，且呈現(xiàn)逐年增加趨勢。面對激增的不孕不育人口，我國的輔助生殖機構(gòu)也由2005年的37家發(fā)展到2013年的358家[3]。輔助生殖機構(gòu)的快速增長也對輔助生殖技術(shù)（artificial reproductive technology，ART）的開展提出更高的要求。本文以卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）為例，介紹浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院體外受精實驗室對顯微注射系統(tǒng)操作的改進措施和經(jīng)驗總結(jié)，為其他新建IVF實驗室順利開展ICSI技術(shù)提供參考。

1 ICSI顯微注射系統(tǒng)的組成及在新建IVF實驗室使用時易出現(xiàn)的問題

1.1 ICSI顯微注射系統(tǒng)的組成

ICSI顯微注射系統(tǒng)大致由倒置顯微鏡、顯微注射儀、顯微注射針3部分組成（圖1）。其中，倒置顯微鏡備有×10的目鏡以及×10、×20、×40的物鏡頭，調(diào)整放大倍數(shù)至200倍能使精子及卵子處于較佳的操作視野下[4]。顯微注射儀為一套液壓或氣壓傳動的連接注射器的負壓控制裝置，目前常用的有日本的Narashige、PrimeTech,德國的Eppendorf以及英國的Research Instruments（RI），其中德國的Eppendorf CellTram vario（圖1(b)）由于具備位置記憶功能,具有（1∶1和1∶10）兩種調(diào)節(jié)精度的旋鈕，且其油壓控制系統(tǒng)較RI等氣壓系統(tǒng)免去了制備平衡用培養(yǎng)皿等步驟，而被更多IVF實驗室采用[5]。顯微注射針為頭部具有一定傾斜角度的細針，其內(nèi)徑一般為4.8~ 5.6mm，外徑為6.8~7.8mm，內(nèi)徑過小則在吸入精子時容易損傷其頭部，內(nèi)徑太大則可能增加對卵母細胞的損傷[6]，ICSI操作時易選用30°角、內(nèi)徑為5mm的注射針[4-5]。

圖1 ICSI顯微注射系統(tǒng)組成

1.2 新建IVF實驗室在使用顯微注射系統(tǒng)時易出現(xiàn)的問題

（1）顯微注射儀液壓管路易堵塞。新建成的IVF實驗室，由于運行初期患者數(shù)量所限，開展的ICSI例數(shù)遠小于大型成熟生殖中心。此外，ICSI的實施還需滿足特定的指征（嚴(yán)重或極少弱精子癥、前次IVF不受精或受精率<30%等），這就會出現(xiàn)新建IVF實驗室某個時間段（1~2個月）因無符合指征的患者而使得顯微注射儀處于閑置狀態(tài)。雖然Eppendorf CellTram vario顯微注射儀在使用說明書上明確印有液壓管路內(nèi)的填充質(zhì)——“油（免維護）”字樣，而IVF實驗室指導(dǎo)用書《體外受精-胚胎移植實驗室技術(shù)》[5]以及最新版本的《卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）技術(shù)規(guī)范》[4]中也均無給出需定期更換油性介質(zhì)的建議，大型生殖中心開展ICSI操作是常態(tài)化的，即管路內(nèi)的油長期處于“流動”狀態(tài)，一旦油量下降能夠得到及時的添加更新；而新中心就會出現(xiàn)液壓管路內(nèi)的石蠟油因長期滯留而堵塞管路引起壓力輸出不穩(wěn)定。若油壓過大會導(dǎo)致顯微操作時精子吸入和吐出過快、不易控制，而用顯微注射針進行回吸、破膜時，由于吸力過強而破壞卵母細胞的紡錘體和胞質(zhì)的微管結(jié)構(gòu)，在注射精子時也會因輸注速度過快而帶入過多精子制動劑——聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP），這會干擾精子核的解凝[7]，不利于胚胎的后續(xù)發(fā)育；若油壓過小則難以將精子吸入顯微注射針，而在回吸、破膜時，也會因吸力不足而難以實現(xiàn)破膜，導(dǎo)致精子沒有真正進入卵胞漿內(nèi)，ICSI受精失敗。

（2）顯微注射針易污染或堵塞?！扼w外受精-胚胎移植實驗室技術(shù)》提到，液壓傳動的顯微注射儀，在進行顯微注射前應(yīng)使顯微注射針內(nèi)也充滿液體介質(zhì)（見圖2(a)），同時需避免氣泡產(chǎn)生[5]（見圖2(b)）。對于成熟的生殖中心而言，由于管道內(nèi)的石蠟油處于不斷流動和更新狀態(tài)，加之工作站內(nèi)的環(huán)境達到百級潔凈度，一般不存在針尖污染的情況；但對于新中心而言，油管在不使用時，其一端始終暴露在空氣中，時間過長會出現(xiàn)塵埃顆?；蚱渌喝苣z顆粒黏附管口的情況，而當(dāng)油液充滿注射針時，顆粒物又會隨著油液移動到針尖，甚至形成固-液膠體，造成污染[8]。經(jīng)驗豐富的IVF實驗室會在顯微注射針的中段預(yù)留一段空氣（見圖2(c)），造成顯微注射針內(nèi)液體從針尖至針尾依次為PVP、空氣和礦物油，這樣能很好地規(guī)避管道內(nèi)石蠟油對針尖造成污染的風(fēng)險。但PVP是一種具有較好成膜性的物質(zhì)，與玻璃具有很強的黏附作用，且在空氣中暴露一定時間易形成板結(jié)和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[9]。對于經(jīng)驗豐富的操作人員能在顯微注射針不移出液面的情況下快速完成對十幾枚卵子的單精子注射；但對于新建IVF實驗室的技術(shù)人員，由于操作速度不快，為了盡可能縮短卵母細胞暴露于培養(yǎng)箱外的時間，往往需要以3~5枚卵子為一批，分批實施ICSI顯微注射，而這就存在分批操作間隙，前端吸有PVP的顯微注射針反復(fù)暴露于空氣中，隨著時間和溫度的變化，PVP發(fā)生變性堵塞針尖，造成后續(xù)注射不暢。

圖2 顯微注射針內(nèi)介質(zhì)填充情況

（3）實驗技術(shù)人員因?qū)嶋H操作經(jīng)驗不足而影響ICSI操作質(zhì)量。雖然《卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)技術(shù)規(guī)范》[4]要求技術(shù)人員在正式實施ICSI前需經(jīng)過充分的“動物配子和人類配子操作訓(xùn)練”。但由于條件及倫理的限制，IVF實驗室在籌備建設(shè)階段是無法獲得人類卵子用于ICSI練習(xí)，而“對人類配子的操作練習(xí)”也僅限于對簽署知情同意后男科檢查余下的精子進行制動、吸吐和轉(zhuǎn)移練習(xí)，且無法練習(xí)后續(xù)的回吸、破膜、注射和退針；而“動物配子”，所用到的往往是價格便宜且容易獲得的實驗小鼠的卵子和精子，但小鼠卵子直徑僅約為人類卵子直徑的1/2，而小鼠的精子頭部呈鐮刀狀，其尾部又極長，對其實施ICSI極易發(fā)生崩解[10-11]，模擬練習(xí)效果不佳。此外，由于原衛(wèi)生部頒布的《人類輔助生殖技術(shù)規(guī)范》明文規(guī)定禁止“人類與異種配子的雜交”，故利用人類精子和小鼠的卵子進行ICSI的模擬練習(xí)也是絕不允許的。因此，新建IVF實驗室的人員在初期會由于沒有真正練習(xí)過用人類的精卵顯微注射而影響ICSI操作的效果。

2 ICSI顯微注射操作系統(tǒng)的改進

針對在使用顯微注射系統(tǒng)時易碰到顯微注射儀液壓管路不順暢、顯微注射針易污染或堵塞、實驗技術(shù)人員操作經(jīng)驗不足影響ICSI效果等問題，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院體外受精實驗室對連接了顯微注射針的Eppendorf CellTram vario油壓式手動顯微注射儀的整體通道進行調(diào)整改進，并同時做好對操作細節(jié)的把控，取得了一定的效果，現(xiàn)將改進經(jīng)驗做如下 分享。

2.1 增加顯微注射儀管道內(nèi)礦物油的更換頻次

針對新建IVF實驗室易出現(xiàn)顯微注射儀某一較長時間段處于非工作狀態(tài)，進而導(dǎo)致液壓管路內(nèi)的石蠟油滯留堵塞管路的情況，借鑒其他實驗室在儀器維護方面的經(jīng)驗[12-14]，增加了對管道內(nèi)礦物油的更換頻次。由原先“臨近用完了再加”改為1~2周定期更換新油，即先往“出液”方向轉(zhuǎn)動粗調(diào)旋鈕，將原先管道內(nèi)的石蠟油排出，再往“吸液”方向轉(zhuǎn)動旋鈕，使活塞退至快速加液閥門的正下方，再向閥門口注入新油，并注意觀察注射儀管口的出液情況，確保殘留的老油盡數(shù)排出，并在實驗室質(zhì)量控制本上進行記錄。在進行下一次ICSI操作時，應(yīng)關(guān)注活塞所處管路的相對位置（圖3），過于靠前和靠后均會影響吸吐的操作，而臨時調(diào)整活塞位置需先對顯微注射針進行插拔，這容易使針內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響壓力輸出。

圖3 活塞所處管路的相對位置示意圖

2.2 合理排布顯微注射針內(nèi)的介質(zhì)

針對顯微注射針全部填充油性介質(zhì)時針尖易遭受污染，而PVP-空氣-油的排布又容易使針尖堵塞的問題，將顯微注射針內(nèi)介質(zhì)的排布調(diào)整為PVP-培養(yǎng)油-空氣-礦物油。首先，這樣的排布避免了管道內(nèi)的油進入到針尖，減少了外源性物質(zhì)導(dǎo)入卵子的風(fēng)險；其次，PVP與空氣交界處加入的這段油液能很好地阻隔PVP與空氣的接觸（圖4），減小PVP液變性結(jié)塊的發(fā)生；此外，在卵子分批搬運的間隙，可以先將針尖前端的PVP排出，與“PVP-空氣-油”的排布相比，油層起到了緩沖作用，避免了在排出PVP液的過程中皿內(nèi)氣泡的形成，同時也減小了PVP黏附于玻璃針內(nèi)壁并板結(jié)的發(fā)生；最后，由于ICSI的整個過程中顯微注射針須反復(fù)進出高黏度的PVP液、含血清的HEPES/MOPS緩沖液滴，且在穿刺回吸過程中容易帶出卵母細胞的胞質(zhì)或細胞膜、透明帶的碎片，“PVP-培養(yǎng)油-空氣-礦物油”中的培養(yǎng)油則能起到潤洗針尖的作用。

圖4 100倍鏡下顯微注射針前端介質(zhì)的排布

2.3 把控好ICSI顯微注射的關(guān)鍵細節(jié)步驟

注射系統(tǒng)整體通道的順暢是ICSI成功的前提和必要條件，與此同時，回吸、破膜、注射和退針等細節(jié)步驟的正確實施也直接影響到卵子后續(xù)的受精及發(fā)育。ICSI操作的第一步是精子制動，即通過針尖的按壓和撕拉劃破精子尾部的包膜，使精子在注入卵母細胞后遺傳物質(zhì)得以釋放[15],這一步包括之后的精子的吸取是所有新建IVF實驗室籌備階段練習(xí)最多的內(nèi)容，故基本不存在問題。由于卵母細胞膜具有彈性，即使顯微注射針進針處卵膜出現(xiàn)漏斗狀（圖5(a)），但卵母細胞仍未破裂，此時若實施注射，精子將不能進到卵胞漿內(nèi)，需有一個回吸確認(rèn)破膜的過程[5]（圖5(b)）。此時，注射系統(tǒng)整體通道內(nèi)壓力的穩(wěn)定至關(guān)重要，油壓過大或過小均將導(dǎo)致卵胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)的破壞或ICSI精卵結(jié)合的失敗。在油壓穩(wěn)定的前提下，回吸、破膜操作可遵循“先快后慢再反向”原則，即先快速向“吸液”方向轉(zhuǎn)動細調(diào)旋鈕，再放慢速率，這樣卵膜易破，而當(dāng)觀察到一個快速反流的過程時，則立即朝相反方向轉(zhuǎn)動旋鈕，減小“回吸”對卵胞質(zhì)內(nèi)紡錘體和細胞骨架的損傷；注射精子亦不宜過快（圖5(c)），因慣性作用，操作太快會導(dǎo)致過多PVP進入卵子；退針的同時可緩慢朝“吸液”方向轉(zhuǎn)動細調(diào)旋鈕，將多余的PVP再吸回注射針，以盡量減少注入卵胞質(zhì)內(nèi)的PVP液。

圖5 ICSI顯微注射示意圖

3 改進前后ICSI效果比較

選取2017年4月—2019年1月男方嚴(yán)重或極少弱精子癥來我中心實施ICSI治療的58個周期，分為改進前組（21個周期共129枚卵子），改進后組（37個周期共233枚卵子），且兩組中女方患者生育力各檢測值上無顯著差異。以ICSI后卵子皺縮或無折光度判定其退化，以ICSI后第二天形成雙原核（2PN）判定其受精，以ICSI后第三天細胞數(shù)（6~10）、卵裂球大小均勻、形態(tài)規(guī)則、透明帶完整、碎片<25%判定其為優(yōu)質(zhì)胚胎，以移植后28天 B超檢查見孕囊判定其臨床妊娠。利用SPSS 17.,0軟件，采用2檢驗對ICSI后卵子退化率、受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎形成率以及臨床妊娠率進行統(tǒng)計。<0.05表示差異有顯著性。對比見表1。

表1 改進前后兩組ICSI效果比較

注：與改進前組相比，*<0.05

4 結(jié)語

本文結(jié)合使用ICSI顯微操作系統(tǒng)時碰到的實際問題，給出了增加顯微注射儀管道內(nèi)礦物油的更換頻次、合理排布顯微注射針內(nèi)的介質(zhì)、把控好ICSI顯微注射的關(guān)鍵細節(jié)步驟等針對性解決方案，并取得了較好的效果，可供其他新建IVF實驗室參考借鑒。

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Exploration on improvement of microinjection system manipulation in newly constructed in-vitro fertilization laboratory

RAO Jinpeng1, QIU Feng1, CAI Yiting1, JIN Fan2, JIN Min1

(1. In-vitro Fertilization Laboratory, Second Affiliated Hospital, Medical School of Zhejiang University, Hangzhou 310052, China; 2. Key laboratory of Reproductive Genetics of Ministry of Education, Women’s Hospital, Medical School of Zhejiang University, Hangzhou 310006, China)

In view of the problem that the microinjection manipulation system can’t run steadily in the newly in-vitro fertilization laboratory, which causes the inadequate effect of oocyte membrane puncture or the damage of oocyte spindle during ICSI, the whole channel of the Eppendorf Cell Tram Vario oil-pressure manual microinjector connected with the microinjection needle is adjusted to improve the stability of egg membrane breakage and single sperm injection. By increasing the replacement frequency of mineral oil in the pipeline of microinjector and adjusting the relative position of piston, the smooth hydraulic system can be ensured. By controlling the medium in the microinjection needle from tip to tail in turn as polyvinylpyrrolidone, culture oil, air and mineral oil, the needle tip is not polluted and blocked, and the rhythm of aspiration, film breaking, injection and needle withdrawal is controlled so that the operation of ICSI can be carried out smoothly. After analysis and improvement, the rate of oocyte degeneration decreases significantly after ICSI（<0.05）, while the fertilization rate, high quality embryo formation rate and clinical pregnancy rate increase.

ICSI; microinjection needle; microinjector; hydraulic system; clinical pregnancy rate

R318.6

B

1002-4956(2019)09-0082-05

2019-01-28

國家自然基金項目（81601268）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目（2019PY028）

饒金鵬（1987—），男，浙江杭州，碩士，實驗師，主要研究方向為輔助生殖實驗室技術(shù)及相關(guān)新型工具設(shè)計開發(fā)。

E-mail: min_jin@zju.edu.cn

金敏（1976—），女，浙江溫州，博士，主任醫(yī)師，主要研究方向為輔助生殖及生殖內(nèi)分泌。

E-mail:rao_jinpeng@zju.edu.cn

10.16791/j.cnki.sjg.2019.09.021