江 鋒，趙振宇，聶 葉，李清亮，劉 松，王和玉

（貴州茅臺酒股份有限公司，貴州仁懷 564501）

乳酸（Lactic acid）學名2-羥基丙酸，結構式為CH3CHOHCOOH，相對分子質量為90.08，由于分子內含有一個不對稱碳原子，因此具有旋光異構現(xiàn)象[1]，可區(qū)分為L-乳酸和D-乳酸，當兩者以等比例混合時，即成為內消旋的DL-乳酸。

目前，分離和測定L-乳酸與D-乳酸手性對映體的方法主要包括酶法[2]、氣相色譜(GC)[3]、氣質聯(lián)用(GC-MS)[4]、毛細管電泳(CE)[5]、液質聯(lián)用(LCMS)[6]、手性高效液相色譜法(HPLC)[7]以及柱前衍生將手性對映體改變成非手性物質再用HPLC 測定的方法[8]。不同的方法都有局限性，如酶法測定步驟多，酶易失活，測定誤差大；EDTA 定鈣法測量誤差大，對乳酸的兩種對映體無法精確定量，如果采用普通的有機酸色譜柱，是無法區(qū)分乳酸的兩種對映體的。

自然界中天然的乳酸是L-乳酸，D-乳酸主要通過合成產生。D-乳酸的合成方法可以分為化學合成法、酶法和微生物發(fā)酵法。乳酸是白酒中重要的有機酸，其含量的多少對白酒的口味和后味有較大影響，國內暫無白酒中乳酸構型的文獻報道。因此，建立能快速、靈敏和高效拆分檢測白酒中兩種乳酸對映異構體的方法非常必要。

本研究利用手性色譜柱中青霉胺與二價銅離子配位體，對乳酸的兩種對映體的絡合能力的不同[9]，將L-乳酸和D-乳酸進行拆分并定量，研究了該法對于乳酸標準品和酒樣樣品的乳酸檢測重現(xiàn)性，還研究了在白酒中添加L-乳酸和D-乳酸標準品后的檢測回收率，最后用該法檢測了20 種市售白酒中的L-乳酸和D-乳酸含量。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：白酒，包括濃香型、醬香型、清香型等市售的白酒20種。

試劑：L-乳酸，色譜純，98%純度，Sigma-Aldrich 公司出品；D-乳酸，色譜純，93%純度，Sigma-Aldrich 公司出品；異丙醇，天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心。

儀器設備：超高效液相色譜儀(Agilent 1260 Series)帶二極管陣列檢測器、手性柱Chirex 3126(D)-penicillami（4.6 mm i.d×250 mm L,5 μm）（美國菲羅門）、分析天平（METTLER TOLEDO XP205）、純水儀（艾科浦RM-220）；Talboys 數(shù)顯型多管式旋渦混合器（美國）；KQ-500DA 昆山超聲儀器（昆山舒美）；BLC-1玻璃砂芯過濾裝置，0.45 μm濾膜（安捷倫，再生纖維素濾膜）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理

取1 mL 酒樣置于10 mL 離心管中，加入4 mL超純水，旋渦振蕩混勻，經水系0.22 μ m 的微孔濾膜過濾后用于液相色譜測定。

1.2.2 色譜條件

流動相：2 mmol/L 的5%異丙醇流動相溶液配制，稱取CuSO4·5H2O 0.500 g，加入50 mL雙蒸水溶解，轉移至100 mL 的容量瓶中，加入50 mL 的色譜純異丙醇，再用雙蒸水定容至1000 mL，用0.45 μ m孔徑的合成纖維素濾膜進行真空超濾，超聲波脫氣；流動相流速為1 mL/min；柱溫30 ℃；二極管陣列檢測器，檢測波長為254 nm；標準品和樣品溶液用前均經過0.22 μm濾膜過濾；進樣量為5 μL。

1.2.3 標準曲線的制作

分別準確稱取一定量的L-乳酸、D-乳酸標準品，用超純水溶解并定容于100 mL 容量瓶中，配成L-乳酸、D-乳酸標準液，然后進行稀釋，分別配成0.020mg/mL、0.050mg/mL、0.100mg/mL、0.200mg/mL、0.400 mg/mL、0.600 mg/mL、0.800 mg/mL 的標準溶液。上機前經0.22 μ m的微孔濾膜過濾。

1.2.4 定性與定量

將相同色譜條件下的樣品色譜圖與乳酸標準液色譜圖進行對照，根據(jù)保留時間確定樣品中的L-乳酸、D-乳酸。用外標法定量，計算出樣品中L-乳酸和D-乳酸的含量。

1.2.5 精密度試驗

取一定濃度的L-乳酸、D-乳酸標準品溶液，連續(xù)進樣6 次，觀察L-乳酸和D-乳酸的保留時間及峰面積，計算RSD值。

1.2.6 重現(xiàn)性試驗

取同一個酒樣6 份，觀察保留時間和峰面積，計算保留時間和峰面積的RSD值。

1.2.7 回收率試驗

分別向已知L-乳酸、D-乳酸濃度的酒樣中加入3 種濃度的L-乳酸、D-乳酸標準品溶液，取5 μL注入液相色譜儀，重復進樣3 次，觀察保留時間和分析含量，計算保留時間的RSD 值和含量的回收率。

2 結果與討論

2.1 手性柱HPLC 法對乳酸標準品與白酒中乳酸的手性拆分和檢測

乳酸2種對映體手性拆分HPLC圖譜見圖1。

圖1 乳酸2種對映體手性拆分HPLC圖譜

由圖1可知，乳酸對映體L-乳酸的出峰時間約為13.0 min，D-乳酸的出峰時間約為16.0 min，根據(jù)乳酸標準品的濃度和峰面積，得L-乳酸標準曲線方程為Y=2.05X+0.673，回歸系數(shù)R2=0.999；D-乳酸的標準曲線方程為Y=1.633X+0.86，回歸系數(shù)R2=0.999。式中X 為乳酸濃度（g/L），Y 為乳酸的峰面積。

根據(jù)標準曲線方程和圖1 的出峰時間與峰面積，可計算L-乳酸和D-乳酸的含量，可知該白酒酒樣中以D-乳酸為主，D-乳酸的含量占乳酸總量的86%以上。本研究利用手性柱Chirex 3126 檢測L-乳酸和D-乳酸，Chirex 3126 是一種配體交換柱，以固相化與過渡金屬離子（Cu2+）配位的配體為固定相，基于流動相中的配體與固定相的配體間交換平衡以及穩(wěn)定性來分離L-乳酸和D-乳酸[9]。

2.2 精密度試驗

對待測L-乳酸、D-乳酸標準品平行測定6 次，結果表明精密度滿足分析要求，其結果見表1。

2.3 重復性試驗

取酒樣1樣品，連續(xù)取6份，測定L-乳酸、D-乳酸的含量，其結果見表2。

2.4 回收率試驗

為了考察測定結果的準確性，進行了回收率的測定，結果見表3。可以看出，L-乳酸的回收率分別為98.47%、100.75%、100.71%，RSD 分別為0.13%、0.59%、0.75%；D-乳酸的回收率分別為107.88%、105.65%、100.1%，RSD 分別為0、0.75%、1.17%。回收率在98.47%～107.88%之間，RSD小于2%，說明該方法測定結果比較可靠。

表1 精密度試驗

表2 重復性試驗

表3 回收率試驗

2.5 最低檢出限的測定

用L-乳酸、D-乳酸標準溶液進行逐步稀釋后，進行HPLC 分析，以3 倍信噪比計算最低檢出限為5 mg/L。

2.6 利用手性柱HPLC 法檢測白酒產品中L-乳酸和D-乳酸的含量

利用手性柱HPLC 方法測得白酒樣品JY1—JY20 中L-乳酸和D-乳酸含量，酒樣包括濃香型、醬香型、清香型等市售的白酒。白酒中L-乳酸和D-乳酸的含量見表4。

結果表明，大部分酒樣里D-乳酸明顯高于L-乳酸，只有JY10、JY13、JY16 的L-乳酸與D-乳酸含量相近。

3 結論

采用高效液相法和手性柱可以將白酒中的L-乳酸和D-乳酸分開，L-乳酸和D-乳酸的標準曲線在0.020～0.800 g/L 范圍線性良好，兩者的線性相關系數(shù)都為0.999。白酒中L-乳酸和D-乳酸的回收率分別是98.47%～100.75%和100.10%～107.88%。該方法操作簡便，精密度和準確度高，適用于白酒中L-乳酸和D-乳酸的測定。

表4 20種市售白酒的L-乳酸和D-乳酸含量