張愛(ài)菊，戴興德，張小林

(甘肅醫(yī)學(xué)院 公共課教學(xué)部，甘肅 平?jīng)?744000)

青霉素(Penicillin)是最早發(fā)現(xiàn)的一種抗生素，也是臨床應(yīng)用最廣泛的抗生素，其測(cè)定方法有滴定法[1]、微生物法[2]、羥胺法[3]、指示電極法[4]等。然而上述方法在測(cè)定時(shí)均因共存物質(zhì)有干擾，很難做到痕量分析。高效液相色譜法[5]憑借其準(zhǔn)確度高、專屬性強(qiáng)的特點(diǎn)廣泛用于牛奶中青霉素的測(cè)定，但是該方法儀器較為大型笨重，前期樣品處理過(guò)程復(fù)雜，并且檢測(cè)非常耗時(shí)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

930N熒光分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；分析天平(0.1 mg，上海天平儀器廠)；pHS-3C精密pH計(jì)(上海雷磁儀器廠)。

RB(固體，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)，青霉素G鉀(美國(guó)Sigma公司)，單質(zhì)碘、醋酸、濃鹽酸(天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司)，氫氧化鈉、醋酸鈉(天津市百世化工有限公司)，碘化鉀(上海銀典化工有限公司),各種金屬離子水溶液(Al3+、Ba2+、Ca2+、Na+、K+、Mg2+、Ni2+、Zn2+、Mn2+、Fe3+)均由其相應(yīng)的硝酸鹽或鹽酸鹽(天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司) 制得，乳糖、淀粉、糊精(天津大茂化學(xué)試劑廠)，硬脂酸(天津北辰方正試劑廠)，抗壞血酸(成都金山化學(xué)試劑有限公司)。所用試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

RB標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取0.119 8 g RB固體，加水溶解并稀釋定容至250 mL，配成濃度為1.00×10-3mol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為儲(chǔ)備液，使用時(shí)稀釋至1.00×10-4mol/L。

青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.00×10-4mol/L)：準(zhǔn)確稱取青霉素G鉀1.000 0 g，加水溶解稀釋定容至100 mL，配成濃度為2.76×10-2mol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為儲(chǔ)備液，使用時(shí)稀釋至1.00×10-4mol/L。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

在50 mL容量瓶中，加入青霉素樣品液(<0.05 mol/L) 1.00 mL和1.0 mol/L氫氧化鈉1.00 mL，振蕩反應(yīng)30 min，加1 mol/L鹽酸1.00 mL、1.00×10-3mol/L碘標(biāo)準(zhǔn)溶液2.00 mL，繼續(xù)反應(yīng)20 min，依次加入1.00×10-4mol/L RB 5.00 mL，0.1 mol/L 醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH 4.5)5.00 mL，蒸餾水定容，靜置10 min后，以365 nm作激發(fā)波長(zhǎng)，580 nm作發(fā)射波長(zhǎng)，1.0×10-6mol/L RB作為靈敏度調(diào)試液，測(cè)定熒光強(qiáng)度IF。同時(shí)完成空白試驗(yàn)IF0測(cè)定，根據(jù)ΔIF(ΔIF=IF-IF0)確定青霉素含量。

圖1 不同體系的熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra of different systemsc(PNC)=3.0×10-6 mol/L;pH 4.5

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜

2.2 RB用量的影響

2.3 碘液用量

圖2 pH值對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of pH value on the fluorescence intensity

2.4 pH值的影響

2.5 反應(yīng)溫度與時(shí)間的優(yōu)化

圖3 動(dòng)力學(xué)曲線Fig.3 Kinetic curvesa.penicillin hydrolysis,b.fluorescence recovery,c.fluorescence quenching

2.6 試劑加入順序的影響

2.7 干擾離子的影響

考察了藥劑中經(jīng)常使用的賦形劑和添加劑以及陽(yáng)離子對(duì)測(cè)定的干擾。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，測(cè)定誤差≤±5%時(shí)，50倍的乳糖、硬脂酸、淀粉、糊精及100倍的 Al3+、Ba2+、Ca2+、Na+、K+、Mg2+、Ni2+、Zn2+、Mn2+離子對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)干擾，但Fe3+和抗壞血酸存在干擾。而常用藥品附加成分和輔料中很少含有Fe3+，故在此不予討論；抗壞血酸的干擾可通過(guò)加入氫氧化鈉進(jìn)行消除。

2.8 方法的工作曲線

取青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00～3.00 mL作為測(cè)試液，在最佳條件下進(jìn)行熒光測(cè)定，并繪制工作曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，青霉素濃度(c,μmol/L)在0～6 μmol/L范圍內(nèi)與熒光強(qiáng)度變化值(ΔIF)呈良好的線性關(guān)系，其線性方程為ΔIF=31.96c+3.794，r=0.996 9。根據(jù)IUPAC規(guī)定，對(duì)空白溶液進(jìn)行11次平行測(cè)定，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差Sb,依據(jù)公式:檢出限(LOD)=3Sb/slope，得到本方法的LOD為1.88×10-9mol/L。

2.9 實(shí)際樣品的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取不同批次注射用青霉素鈉(哈藥集團(tuán))固體0.1 g，蒸餾水溶解并定容至100 mL，再將溶解液稀釋50倍，取稀釋液1.00 mL，按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，完成加標(biāo)回收試驗(yàn)，并與高效液相色譜法對(duì)照。結(jié)果顯示，本法準(zhǔn)確度和靈敏度良好，加標(biāo)回收率為97.0%～106%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%～3.1%，且測(cè)定結(jié)果與高效液相色譜法基本一致，相對(duì)誤差(RE)<2.0%。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 實(shí)際樣品中青霉素的測(cè)定(n=6)Table 1 Determination of penicillin in actual samples(n=6)

3 結(jié) 論