韓 梅，侯 雪，邱世婷，焦 穎，羅曉梅，先正其，王 天

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 分析測試中心，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(成都)，四川 成都 610066；2.賽默飛世爾科技(中國)有限公司，上海 201206)

百草枯又名對草快，是雜環(huán)類除草劑，屬于吡啶類衍生物，極易溶于水，微溶于醇類及丙酮，不溶于烴類，在酸性及中性溶液中穩(wěn)定，在堿性溶液中易分解[1]。其對人、畜有較強的急性毒性，且無特效解毒藥。作為速效滅生性除草劑，百草枯曾廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，但目前已被20多個國家禁用或限用。我國自2016年7月1日起停止在國內(nèi)銷售和使用百草枯水劑，2020年9月26日起禁止在境內(nèi)銷售和使用百草枯可溶膠劑[2]。國家標準GB 2763-2016對蔬菜、水果、谷物、油料中的百草枯作出了限量要求，規(guī)定各類蔬菜中百草枯允許的最大殘留限量為0.05 mg/kg[3]。由于百草枯的高毒性和廣泛應(yīng)用性，因此建立快速、高選擇性、高靈敏度的百草枯檢測方法非常必要。

目前有關(guān)百草枯的前處理主要采用固相萃取柱凈化[4]，方法較為復(fù)雜；檢測方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法[5-6]、高效液相色譜法[4,7-9]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-13]，但上述方法對復(fù)雜基質(zhì)的抗干擾能力不足，易出現(xiàn)假陽性；而靜電場軌道離子阱(Orbitrap)可在很大程度上彌補上述不足。高分辨質(zhì)譜具有較強的抗干擾能力和高通量，且前處理簡單，能解決基質(zhì)干擾問題。其中，四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(Q-Exactive)是將四極桿與Orbitrap相結(jié)合，不僅具有很好的定性效果，且顯著改善了高分辨質(zhì)譜的定量效果，可與三重四極桿質(zhì)譜相媲美[14-15]。目前將Orbitrap高分辨質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于蔬菜中百草枯的檢測尚未見報道。

本研究建立了蔬菜中百草枯殘留的超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(UHPLC-Q-Exactive MS)分析方法，樣品以乙腈-0.2%甲酸水溶液(1∶1，體積比，下同)提取，分散固相萃取(DSPE)法凈化。該方法前處理簡單快速、靈敏度高，適用于蔬菜樣品中百草枯的快速檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Q-Exactive 四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(配加熱電噴霧離子(HESI)源)、Thermo UltiMate 3000 高效液相色譜儀，配置六通道在線脫氣機、自動進樣器(帶大體積進樣組件)、柱溫箱(帶2位六通閥)、雙三元梯度泵(美國Thermo Fisher公司)；WH-3微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠)；TGL-16LM高速離心機(湖南星科科學(xué)儀器有限公司)；AE240電子天平(瑞士Mettler公司)。

標準品：百草枯二氯鹽標樣(純度大于99.0%，DR.Ehrenstorfer公司)。

乙腈、甲酸、甲酸銨、乙酸銨(色譜純，美國Fisher Scientific公司)；鹽酸(優(yōu)級純，四川西隴化工有限公司)；十八烷基鍵合硅膠(C18)吸附劑、N-丙基乙二胺(PSA)和石墨化碳黑(GCB)(上海安譜實驗科技股份有限公司)；實驗用水為純凈水(由Milli-Q超純水儀制備)。蔬菜樣品來自四川省農(nóng)貿(mào)市場及蔬菜基地抽檢樣。

1.2 標準溶液的配制

稱取適量百草枯標準品，用0.1 mol/L鹽酸配制成20 mg/L標準儲備溶液，于-4 ℃保存。根據(jù)需要，用試劑或基質(zhì)溶液配制標準儲備溶液，得到不同質(zhì)量濃度的標準工作溶液。

1.3 樣品前處理

準確稱取5 g(精確至0.01 g)蔬菜樣品于50 mL塑料離心管中，加入10 mL乙腈-0.2%甲酸水溶液(1∶1)，渦旋提取1 min后，以4 000 r/min離心5 min，取上層提取液至25 mL容量瓶中，殘留物用10 mL乙腈-0.2%甲酸水溶液(1∶1)重復(fù)提取1次，合并提取液于同一容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻。取6 mL提取液于預(yù)先加有300 mg PSA 和300 mg C18的10 mL塑料離心管中，渦旋1 min后，再以4 000 r/min離心力離心5 min。取上清液過0.22 μm濾膜后，待測。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件色譜柱：Acquity UPLC BEH HILIC柱(100 mm× 2.1 mm，1.7 μm，美國Waters公司)；流動相：A為0.2%甲酸水溶液(含50 mmol/L甲酸銨)，B為乙腈；流速：0.3 mL/min；進樣量：10 μL，柱溫：40 ℃。梯度洗脫程序：0～1.0 min，70%B；1.0～2.0 min，70%～20%B；2.0～4.0 min，20%B；4.0～4.1 min，20%～70%B；4.1～10.0 min，70%B；分析時間：10.0 min。

1.4.2 質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源(ESI源)；噴霧電壓：3 kV；采集方式：正離子采集模式；檢測方式：平行反應(yīng)監(jiān)測(PRM)，分辨率：17 500，碰撞能量：21 eV；鞘氣壓力：3.5 MPa，輔助氣壓力：1 MPa；離子傳輸溫度：350 ℃；輔助加熱溫度：400 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

百草枯為堿性離子型化合物，易溶于酸性水溶液，不易溶于乙腈等有機試劑，但純水溶液以及酸性水溶液對蔬菜中百草枯的提取效率并不高，而通過加入一定比例的乙腈可以顯著提高回收率[16]。本研究分別選取水、0.2%甲酸水溶液、2%甲酸水溶液、乙腈、乙腈-0.2%甲酸水溶液(1∶1)以及乙腈-2%甲酸水溶液(1∶1)作為提取溶劑，結(jié)果顯示，乙腈-0.2%甲酸水溶液(1∶1)和乙腈-2%甲酸水溶液(1∶1)為提取溶劑時百草枯的回收率均超過90%?？紤]到酸度過大對儀器、色譜柱性能有影響，因此選擇乙腈-0.2%甲酸水溶液(1∶1)為提取溶劑。進一步比較了不同體積比(1∶9、3∶7、1∶1、7∶3、9∶1)的乙腈-0.2%甲酸水溶液的提取效率，發(fā)現(xiàn)兩者比例為1∶1時百草枯的提取回收率較好且穩(wěn)定，故最終選擇乙腈-0.2%甲酸水溶液(1∶1)為提取溶劑。

2.2 凈化方式的選擇

由于蔬菜基質(zhì)較復(fù)雜，需將提取液進一步凈化，從而減少對儀器的損傷以及基質(zhì)效應(yīng)。本研究采用DSPE技術(shù)進行凈化，并對PSA、C18和GCB凈化劑進行考察。其中PSA 能有效去除提取液中的極性物質(zhì)、有機酸和脂肪酸等雜質(zhì)；C18對親脂性雜質(zhì)和脂肪等具有較好的吸附效果；而GCB可吸附色素、甾醇等大分子非極性干擾物[17]。

比較了無凈化劑和采用上述不同凈化劑對百草枯回收率的影響。結(jié)果顯示，不使用凈化劑時的回收率能達到分析要求，但雜質(zhì)較多，不利于儀器維護；而單獨使用1種凈化劑時的回收率相對較差。由于本實驗提取出的色素相對較少，而C18具有一定的去除色素能力，且C18和PSA配合使用對雜質(zhì)的吸附范圍較廣，因此選用C18和PSA進行凈化處理。進一步實驗發(fā)現(xiàn)，6 mL樣品提取液使用300 mg PSA和300 mg C18即可達到凈化效果，當(dāng)增加吸附劑用量時，凈化效果并無明顯改善。因此實驗采用300 mg PSA和300 mg C18進行DSPE凈化。

2.3 質(zhì)譜與色譜條件的優(yōu)化

2.3.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化根據(jù)百草枯的結(jié)構(gòu)特征，選擇ESI+作為電離模式。先用全掃描(Full scan)模式找到百草枯的母離子、子離子，然后采用 PRM模式對百草枯進行定性和定量采集。在 PRM 模式下，進一步對二級質(zhì)譜的碰撞能量(CE)進行優(yōu)化，結(jié)果顯示，CE值為21 eV時能夠獲得最佳的二級質(zhì)譜定量離子響應(yīng)(圖1A)。由圖1A可知，母離子的精確質(zhì)量數(shù)為m/z186.113 05，二級質(zhì)譜特征子離子的精確質(zhì)量數(shù)為m/z171.091 19，理論上母離子的分子式為C12H14N2，精確質(zhì)量數(shù)為186.115 15，實際與理論的精確質(zhì)量數(shù)相差≤5 ppm[18]，質(zhì)量準確度能夠滿足要求。圖1B為百草枯定量子離子的提取離子色譜圖。

2.3.2 流動相的選擇參考標準SN/T 0293-2014[4]，本實驗選擇乙腈作為流動相的有機相?？疾炝瞬煌琾H值的水系流動相(純水、甲酸水溶液)對百草枯分離效果的影響，結(jié)果表明，不加酸或流動相酸度較高時，峰形較差。而在流動相中添加0.2%甲酸時，可提高百草枯的離子化效率，分離效果滿意。這是由于流動相中加入甲酸，可促進化合物的離子化[19]；而百草枯為堿性化合物，甲酸能調(diào)節(jié)流動相的pH值使之呈酸性，在正離子模式下，流動相呈酸性有利于提高百草枯的離子化效率和靈敏度，改善其峰形[20]。因此，選擇乙腈和0.2%甲酸水溶液為流動相。

進一步比較流動相中添加鹽的分離效果，考察了乙腈-0.2%甲酸水溶液、乙腈-0.2%甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸銨)、乙腈-0.2%甲酸水溶液(含5 mmol/L甲酸銨)、乙腈-0.2%甲酸水溶液(含10 mmol/L甲酸銨)、乙腈-0.2%甲酸水溶液(含50 mmol/L甲酸銨)、乙腈-0.2%甲酸水溶液(含100 mmol/L甲酸銨) 6種流動相體系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動相中加入銨鹽可改善峰形，且加入甲酸銨比加入乙酸銨的峰形更好，色譜柱達到平衡狀態(tài)的時間更短。另外，隨著甲酸銨的濃度升高，峰形變得尖銳，響應(yīng)值增大。當(dāng)甲酸銨濃度為50 mmol/L和100 mmol/L時，峰形和響應(yīng)值無顯著區(qū)別，但高濃度的甲酸銨會形成鹽析，損傷色譜柱和管路系統(tǒng)。故最終選擇乙腈-0.2%甲酸水溶液(含50 mmol/L甲酸銨)作為流動相。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

本實驗依據(jù)基質(zhì)標準曲線和溶劑標準曲線的斜率比值評價基質(zhì)效應(yīng)，若斜率比值>1，則表示基質(zhì)對分析物的響應(yīng)產(chǎn)生增強效應(yīng)；若斜率比值<1，則表示產(chǎn)生抑制效應(yīng)；若斜率比值為1，則表示不存在基質(zhì)效應(yīng)。當(dāng)斜率比值為0.8～1.2時，表示基質(zhì)干擾程度較低；當(dāng)斜率比值為0.5～0.8或1.2～1.5時，表示有中等程度的基質(zhì)干擾效應(yīng)；當(dāng)斜率比值小于0.2或大于1.5時，表示基質(zhì)效應(yīng)干擾強[21]。

采用“1.3”方法得到的空白基質(zhì)提取液和乙腈-0.2%甲酸水溶液(1∶1)分別配制質(zhì)量濃度為0.005～0.5 mg/L的標準溶液，按照本方法進行測定，并繪制基質(zhì)標準曲線和溶劑標準曲線。由表1可見，7種蔬菜中百草枯具有不同程度的基質(zhì)增強效應(yīng)。本實驗采用基質(zhì)匹配標準工作溶液外標法進行定量，以降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.5 線性關(guān)系與檢出限

以“1.3”方法得到的空白基質(zhì)提取液，配制質(zhì)量濃度為0.08～500 μg/L的百草枯基質(zhì)匹配標準溶液。在“1.4”條件下進行測定，以百草枯的質(zhì)量濃度(x，mg/L)為橫坐標，響應(yīng)峰高(y)為縱坐標，繪制標準工作曲線。表1結(jié)果表明，百草枯在不同蔬菜基質(zhì)(番茄、辣椒、茄子、黃瓜、菜豆、芹菜、油麥菜)中線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.992 7～0.999 4。并以信噪比S/N≥3 確定儀器的檢出限(LOD)，S/N≥10 確定儀器的定量下限(LOQ)，得到百草枯的 LOD和LOQ分別為0.1～0.5 μg/kg和0.4～1.8 μg/kg，能夠滿足主要蔬菜品種中百草枯的限量要求[3]。

表1 百草枯在蔬菜中的基質(zhì)效應(yīng)、線性關(guān)系、檢出限和定量下限Table 1 Matrix effects,linear relationships，limits of detection(LOD) and limits of quantitation(LOQ) of paraquat in vegetables

2.6 準確度與精密度

選用7種代表性蔬菜空白樣品，在優(yōu)化條件下進行加標回收實驗，加標水平為50、100、200 μg/kg。由表2可知，百草枯在7種不同蔬菜中的平均回收率為70.8%～113%，相對標準偏差(RSD)為0.30%～7.9%，方法的準確度和精密度符合農(nóng)藥殘留分析的要求[18]。圖2為黃瓜基質(zhì)中添加50 μg/kg百草枯的總離子流圖和提取離子流圖。

表2 不同加標水平下百草枯的平均回收率和相對標準偏差(n=6)Table 2 Average recoveries and relative standard deviations of paraquat at different spiked levels(n=6)

圖2 黃瓜中添加百草枯(50 μg/kg)的總離子流圖(A)和提取離子流圖(B)
Fig.2 Total ion chromatogram(A) and extracted ion chromatogram(B) of paraquat spiked in cucumber(50 μg/kg)

2.7 實際樣品測定

應(yīng)用本方法對四川省多個地區(qū)隨機抽取的36個番茄、33個茄子、33個辣椒、41個黃瓜、10個菠菜、9個芹菜、5個小白菜、5個萵苣、4個普通白菜、3個土豆、2個蓮花白、2個蘿卜和2個芫荽樣品中的百草枯進行測定。結(jié)果顯示，從川西平原抽檢的2個小白菜、1個普通白菜、1個蓮花白和1個芫荽中檢出百草枯，含量分別為2.06、3.14、3.16、2.31、15.6 μg/kg，說明該地區(qū)曾有使用百草枯的現(xiàn)象，具體來源需進一步研究。

3 結(jié) 論

本方法采用乙腈-0.2%甲酸水溶液(1∶1)提取、分散固相萃取凈化，超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜快速定性篩查和定量分析蔬菜中的百草枯，利用PRM模式監(jiān)測其子離子的精確質(zhì)量數(shù)，進一步降低了背景噪音，從而提高了靈敏度和準確性。結(jié)果表明，蔬菜中百草枯的檢出限為0.1～0.5 μg/kg，定量下限為0.4～1.8 μg/kg，平均回收率為70.8%～113%，相對標準偏差為0.30%～7.9%。該方法前處理操作簡單快速，靈敏度高，準確性好，可用于主要蔬菜品種中百草枯的檢測。