王學(xué)文，朱祥宇，李永清

(1.中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京 102629； 2.北京大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，北京 100044； 3.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100097)

流行性感冒簡(jiǎn)稱為流感，是一種急性呼吸道傳染病，它是由流感病毒引起的。流感病毒感染為急性感染，主要由呼吸道侵入機(jī)體，在呼吸道的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖，引起細(xì)胞變性壞死和脫落，進(jìn)而影響到支氣管、細(xì)支氣管、肺泡及支氣管其周圍組織，甚至引起肺泡壁充血水腫、滲出液和纖維蛋白增加以及中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的浸潤(rùn)等[1-2]。肺作為流感病毒的靶器官，藥物能否抑制流感病毒在靶器官中復(fù)制是衡量抗病毒藥效的指標(biāo)之一[3]。

某些中藥具有抑制病毒的復(fù)制、阻止病毒引起細(xì)胞病變、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、改善肺循環(huán)和鎮(zhèn)痛抗炎等綜合功效，且病毒難以對(duì)其產(chǎn)生抗藥性，因此篩選安全有效的中藥一直是防治甲型流感病毒感染的研究熱點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)選用的復(fù)方中藥是北京洪天力藥業(yè)有限公司提供臨床經(jīng)驗(yàn)方，由蒲公英、百部、白薇、白術(shù)等多味中藥組方而成的復(fù)方中藥，是針對(duì)解熱鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗感染、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫功能而組方[4-8]。

本實(shí)驗(yàn)通過流感病毒A/PR/8/H1N1感染小鼠成功建立模型后，觀察該復(fù)方中藥對(duì)流感病毒A/PR/8/H1N1感染小鼠所致肺損傷的影響，為復(fù)方中藥抗流感病毒的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)BALB/c小鼠，雌性90只，6 ～ 8周齡，體重18 ～ 22 g，購(gòu)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部[SCXK (京) 2011-0012]。取回后飼養(yǎng)于北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所隔離器中[SYXK (京) 2012-0034]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)符合福利倫理要求，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫利審批號(hào)：20150316-3。

1.1.2 病毒毒株

H1N1鼠肺流感適應(yīng)株A/Puerto Rico/8/1934(以下簡(jiǎn)稱PR8)，有中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)劉金華老師饋贈(zèng)。

1.2 主要試劑與儀器

復(fù)方中藥(北京洪天力藥業(yè)有限公司提供臨床經(jīng)驗(yàn)方)；鹽酸金剛烷胺(美國(guó)Sigma公司)；甲醛溶液(天津市福晨化學(xué)試劑廠)；95%和100%乙醇、二甲苯、伊紅、蘇木素、鹽酸分析純AR級(jí)(北京化學(xué)試劑公司)。

BHC-1300IIA2生物安全柜(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；DW-HL828 -80℃冰箱(中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司)；5810R臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司)；Nikon E200光學(xué)顯微鏡(日本尼康公司)；KD-BM生物組織包埋機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)；RM2016輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)(德國(guó)徠卡公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 試劑配制

PR8先經(jīng)雞胚傳代增殖兩輪，過濾4℃保存?zhèn)溆茫缓鬁y(cè)LD50為10-3.375/50 μL。所有病毒均為-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

復(fù)方中藥實(shí)驗(yàn)前用100℃去離子水配制成需要的濃度。

鹽酸金剛烷胺，含量98%以上，用蒸餾水配制成濃度為10 mg/mL藥液。

1%雞血紅細(xì)胞懸液：將SPF級(jí)成年公雞翅下靜脈取血，分離紅細(xì)胞，用生理鹽水制成體積分?jǐn)?shù)為1%的懸液，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型的建立

將90只雌性BALB/c小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，稱重后隨機(jī)分為6組，每組15只，每籠5只。6組分別為空白對(duì)照組，病毒對(duì)照組，鹽酸金剛烷胺對(duì)照組，復(fù)方中藥高、中、低劑量組。分組及灌胃劑量見表1。

表1 BALB/c小鼠實(shí)驗(yàn)分組

中藥組連續(xù)灌胃2 d后，BALB/c小鼠鎮(zhèn)靜麻醉?？瞻讓?duì)照組每只滴鼻PBS 50 μL，其他各組滴鼻攻毒流感病毒PR8 10 LD50/50 μL。病毒感染4 h后，中藥三個(gè)劑量組經(jīng)灌胃給藥，連續(xù)灌胃5 d，每天一次，0.2 mL/10 g；空白對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃生理鹽水，組鹽酸金剛烷胺組灌胃金剛烷胺藥液，灌胃體積、時(shí)間和方式同中藥三個(gè)劑量組。

1.3.3 肺指數(shù)計(jì)算

病毒感染5 d后，禁食不禁水過夜12 h，稱重取血后處死，打開胸腔并摘取全肺稱重，計(jì)算肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率：

肺指數(shù)=(小鼠肺重/小鼠體重) × 100%；

肺指數(shù)抑制率=(病毒對(duì)照組平均肺指數(shù) - 實(shí)驗(yàn)組平均肺指數(shù))/病毒對(duì)照組平均肺指數(shù) × 100%。

1.3.4 肺組織勻漿懸液的病毒血凝效價(jià)

各組隨機(jī)取6個(gè)肺置于勻漿器中加冷生理鹽水[肺重(g)/生理鹽水(mL)=1/9]，在冰浴中研磨制成勻漿，4℃離心后取上清做微量血凝實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 肺組織形態(tài)學(xué)觀察

BALB/c小鼠死亡后，各組取6只BALB/c小鼠肺，將迅速摘取的肺放入10%的福爾馬林中固定，常規(guī)切片，HE染色，光鏡下觀察組織病理變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方中藥對(duì)流感病毒PR8感染小鼠肺指數(shù)的影響

流感病毒PR8感染小鼠后，連續(xù)灌胃5 d后肺指數(shù)的變化結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，病毒對(duì)照組肺指數(shù)顯著升高(P< 0.01)；與病毒對(duì)照組相比，金剛烷胺組和中藥中劑量組肺指數(shù)顯著降低(P< 0.01)，中藥低劑量組和中藥高劑量組肺指數(shù)顯著降低(P< 0.05)。結(jié)果見由表2。

2.2 復(fù)方中藥對(duì)流感病毒PR8在感染小鼠肺組織中血凝滴度的影響

利用紅血球凝集實(shí)驗(yàn)(HA)測(cè)定PR8感染小鼠后在肺組織中的血凝效價(jià)，反映流感病毒的復(fù)制情況。連續(xù)灌胃5 d后，與病毒對(duì)照組相比，藥物組小鼠肺組織血凝滴度均顯著降低(P< 0.01)，表明各組藥物對(duì)流感病毒均有不同程度的抑制效果，鹽酸金剛烷胺組血凝滴度最低，抑制流感病毒效果最好。復(fù)方中藥各藥物組血凝滴度中劑量組低于高劑量組和低劑量組，說明三個(gè)劑量組中，復(fù)方中藥中劑量組抗流感病毒組效果更好。結(jié)果見表3。

2.3 復(fù)方中藥對(duì)流感病毒PR8感染小鼠肺組織的病理形態(tài)學(xué)影響

復(fù)方中藥對(duì)于PR8感染小鼠5 d后病理形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示：HE染色觀察正常組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)，終末細(xì)支氣管部分向周邊伸展，構(gòu)成呼吸細(xì)支氣管，再分支成肺泡管(腺泡)和肺泡，各級(jí)支氣管結(jié)構(gòu)清楚，肺泡組織內(nèi)基本沒有浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞，滲出。肺泡壁毛細(xì)血管充滿紅細(xì)胞。各級(jí)支氣管周圍間質(zhì)有肺動(dòng)脈、肺靜脈、淋巴組織和疏松結(jié)締組織(圖1A)。

表2 復(fù)方中藥對(duì)流感病毒PR8感染BALB/c小鼠肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率的影響

注：病毒對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，ΔΔP< 0.01；各藥物組與病毒對(duì)照組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. The virus control group compared with the normal control group,ΔΔP< 0.01. Each drug treatment group compared with the virus control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

表3 復(fù)方中藥對(duì)流感病毒PR8感染BALB/c小鼠肺組織中血凝滴度的影響

注：與病毒對(duì)照組相比，**P< 0.01。

Note. Compared with the virus control group,**P< 0.01.

注：A：空白對(duì)照組；B：病毒對(duì)照組；C：金剛烷胺組；D：復(fù)方中藥中劑量組；E：復(fù)方中藥高劑量組；F：復(fù)方中藥低劑量組。圖1 復(fù)方中藥對(duì)PR8感染BALB/c小鼠肺組織的病理形態(tài)學(xué)的影響Note. A, Normal group. B, Virus control group. C, Amantadine group. D, Medium dose compound traditional Chinese medicine group. E, High dose compound traditional Chinese medicine group. F, Low dose compound traditional Chinese medicine group.Figure 1 Effect of the Chinese medicine prescription on the pathology of lung tissues in the PR8-infected BALB/c mice

病毒對(duì)照組大部分肺組織肺泡結(jié)構(gòu)破壞，部分肺組織實(shí)變區(qū)融合，肺泡隔增厚，肺泡腔和間質(zhì)內(nèi)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，病變較重，毛細(xì)血管充血(圖1B，箭頭b)肺泡破壞，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1B，箭頭a)。鹽酸金剛烷胺組連續(xù)7 d灌胃，可明顯改善肺部炎性病變程度，炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少或消退，接近正常肺組織結(jié)構(gòu)(圖1C，箭頭)。

復(fù)方中藥不同劑量組連續(xù)灌胃7 d后，不同程度的改善了肺組織的病變，由切片照片可以看出中劑量組約1/2肺組織炎性細(xì)胞明顯減少，未見充血出血(圖1D，箭頭)。低劑量治療后效果約1/3肺組織炎性細(xì)胞明顯減少，其余的肺組織炎細(xì)胞減少(圖1F，箭頭)。高劑量組約1/3肺組織炎性細(xì)胞明顯減少，抑制作用不如中劑量組明顯(圖1E，箭頭)。

3 討論

流感病毒感染小鼠致肺損傷后，肺淤血水腫，體積變大，且重量增加，而體重往往減輕。肺指數(shù)是指小鼠肺重占體重的百分比[9]。表明肺組織病度越嚴(yán)重，肺重量越大，肺指數(shù)相對(duì)越大[10-12]。解剖觀察到肺葉有淤血、紅腫或壞死灶。藥物治療后，肺部淤血水腫可能減輕或者消失，肺指數(shù)相對(duì)減小。因此肺指數(shù)和肺葉大體外觀變化從宏觀上反映了肺部病變的程度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，流感病毒感染BALB/c小鼠后第5天，與病毒對(duì)照組相比，空白對(duì)照組、鹽酸金剛烷胺組小鼠肺指數(shù)顯著升高(P< 0.01)，說明模型和陽(yáng)性對(duì)照都是成立的。病毒對(duì)照組解剖肺，看到肺嚴(yán)重淤血水腫，病灶累及2個(gè)或以上肺葉。復(fù)方中藥中劑量組灌胃7 d后，與病毒對(duì)照組相比，肺指數(shù)顯著下降(P< 0.01)，高劑量組和低劑量組肺指數(shù)亦顯著下降(P< 0.05)，說明復(fù)方中藥三個(gè)劑量組均有抗炎抗病毒作用，可降低流感病毒感染小鼠的肺指數(shù)。結(jié)合肺組織病理學(xué)分析，空白對(duì)照組肺結(jié)構(gòu)未見改變，肺泡大小正常，細(xì)支氣管粘膜完整，管腔內(nèi)無(wú)分泌物。病毒對(duì)照組顯微鏡下觀察肺部病變明顯，正常的肺組織結(jié)構(gòu)形態(tài)消失，肺泡間隔增厚，肺泡壁和細(xì)支氣管壁大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)漿液性滲出。流感病毒所致的小鼠肺炎病理改變?yōu)榈湫偷拈g質(zhì)性肺炎表現(xiàn)，與報(bào)道[13-15]結(jié)果一致。感染小鼠繼續(xù)灌胃經(jīng)復(fù)方中藥和鹽酸金剛烷胺治療后，肺部病理改變均有一定的改善，炎性細(xì)胞減少，肺組織形態(tài)有所恢復(fù)，這可能是灌胃給予復(fù)方中藥和鹽酸金剛烷胺后，提高小鼠死亡保護(hù)率，生存時(shí)間延長(zhǎng)的直接原因。

紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)(HA)是利用流感病毒與人、豚鼠和雞的紅細(xì)胞發(fā)生凝集的實(shí)驗(yàn)，其原理是流感病毒粒表面的血凝素(HA)蛋白，可以識(shí)別和結(jié)合哺乳動(dòng)物和禽類的紅細(xì)胞表面受體，病毒被吸附到紅細(xì)胞上而相互發(fā)生凝集。HA效價(jià)可作為衡量流感病毒含量的一個(gè)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，流感病毒攻毒組小鼠肺組織病毒血凝效價(jià)最高，說明在感染流感病毒后第5天，流感病毒在肺組織中已大量繁殖。與此同時(shí)，鹽酸金剛烷胺對(duì)照組和復(fù)方中藥各組血凝滴度均顯著降低(P< 0.01)，表明鹽酸金剛烷胺組及復(fù)方中藥各劑量組均可不同程度的降低流感病毒感染小鼠的肺組織病毒血凝滴度，即不同程度的抑制流感病毒的復(fù)制。

綜上所述，肺指數(shù)和肺葉病理形態(tài)學(xué)從宏觀和微觀上反映了肺部病變的嚴(yán)重程度及評(píng)價(jià)藥物的治療效果，而肺組織病毒血凝滴度反應(yīng)了流感病毒在肺部的增殖程度。本實(shí)驗(yàn)復(fù)方中藥治療流感病毒感染的小鼠后，平均肺指數(shù)和平均血凝滴度降低，并且肺部組織病理形態(tài)有了明顯改善。表明復(fù)方中藥通過抑制流感病毒在肺內(nèi)的增殖，來(lái)減輕流感病毒導(dǎo)致的肺損傷，從而改善了肺功能。