郭文鶴，黃娜娜，張曉亮，李曉宇,4，張家祥，齊曉甜，孫 蓉,*

(1.山東大學(xué)第二醫(yī)院，濟(jì)南 250033； 2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱 150076；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250355； 4.山東省中醫(yī)藥研究院，濟(jì)南 250014； 5.山東大學(xué) 高等醫(yī)學(xué)研究院，濟(jì)南 250012)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是引發(fā)心腦血管疾病的重要因素，其發(fā)病機(jī)制主要涉及脂質(zhì)沉積、內(nèi)皮損傷、血小板功能亢進(jìn)、Ca2+超負(fù)荷等[1]方面，其中，內(nèi)皮損傷和脂質(zhì)沉積是公認(rèn)的動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的始動(dòng)因素[2]。祖國醫(yī)學(xué)將其歸為“脈痹”、“中風(fēng)”、“胸痹”等范疇。動(dòng)脈粥樣硬化的臨床分型主要包括氣滯血瘀型、氣虛血瘀型、痰瘀互結(jié)型、氣陰兩虛型[3]。近年來，隨著人們生活水平的提高和生活方式的轉(zhuǎn)變，動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病率呈逐年升高的趨勢(shì)。相比于西藥不良反應(yīng)頻發(fā)，新藥研制遲緩的現(xiàn)狀，中藥著眼整體，標(biāo)本兼治，在防治動(dòng)脈粥樣硬化方面別具一格，前景廣闊。工欲善其事，必先利其器，伴隨中藥抗動(dòng)脈粥樣硬化藥效研究的不斷深入，相應(yīng)的藥效評(píng)價(jià)模型顯得捉襟見肘。目前，動(dòng)脈粥樣硬化病證結(jié)合模型的研究有限，主要包括穢濁痰阻型、痰瘀阻絡(luò)型、氣陰兩虛型[4-5]。氣滯血瘀型作為動(dòng)脈粥樣硬化臨床常見分型，尚無相應(yīng)動(dòng)物模型的報(bào)道。本研究基于動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制的現(xiàn)代研究以及動(dòng)脈粥樣硬化中醫(yī)病因病機(jī)的演變規(guī)律，選擇內(nèi)皮細(xì)胞損傷、脂質(zhì)沉積和“寒凝氣滯”為切入點(diǎn)，擬用尾靜脈注射牛血清蛋白、灌胃脂肪乳和冰水浴三種方法復(fù)合作用構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化(氣滯血瘀)大鼠模型，以期為動(dòng)脈粥樣硬化(氣滯血瘀證)相關(guān)藥物的藥效學(xué)和作用機(jī)制研究提供載體。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠150只，6～8周齡，體重為180 ～ 220 g，購于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK (魯) 2013-0009]。大鼠飼養(yǎng)于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物房屏障環(huán)境[SYXK (魯) 2013-0001]，飼養(yǎng)室室溫20℃ ～ 25℃，相對(duì)濕度(45 ± 10)%，通風(fēng)良好，使用鼠飼料[SCXK (魯) 2017-0014]飼喂大鼠。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理批準(zhǔn)號(hào)[KYLL-2018(KJ)A-0089]，實(shí)驗(yàn)期間按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

通脈顆粒(吉林華康藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)170903051)；辛伐他汀(世貿(mào)天階制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)20170824)；牛血清白蛋白(上海伯奧生物科技有限公司批號(hào)020701)；膽固醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20170607)；脫氧膽酸鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20160329)；6-正丙基-2-硫代尿嘧啶(上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)C10024745)；吐溫80(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20170606)；1,2-丙二醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20170209)；豬油為市售；總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇測(cè)定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇測(cè)定試劑盒均購于南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為20180126、20180126、20180125、20180124。TDZ5-WS型臺(tái)式低速離心機(jī)，湘儀(湖南)離心機(jī)儀器有限公司；Multiskan Go-1510全波長酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；可調(diào)式移液器，上海賽默飛世爾儀器有限公司；木質(zhì)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)脈粥樣硬化(氣滯血瘀證)動(dòng)物模型診療評(píng)價(jià)指標(biāo)抽提

參照《動(dòng)脈粥樣硬化中西醫(yī)結(jié)合診療專家共識(shí)》[3]，動(dòng)脈粥樣硬化(氣滯血瘀證)的主要證候?yàn)樽吒Z疼痛、拒按、局部青紫腫脹?；蛐臒┮着?，情志不遂。舌質(zhì)紫暗、瘀斑。脈沉、脈澀。臨床檢測(cè)指標(biāo)主要包括血脂異常，升主動(dòng)脈見片狀或鈣質(zhì)沉著陰影[3]。依據(jù)血瘀證中西醫(yī)結(jié)合診斷標(biāo)準(zhǔn)及實(shí)用血瘀證學(xué)內(nèi)容，氣滯血瘀證主證為舌質(zhì)紫暗或有瘀斑，齒齦、趾端青紫，間歇性跛行。次證為肢體麻木或偏癱，疼痛，精神狂躁，血液流變學(xué)、凝血功能異常。診斷標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，具備上述兩項(xiàng)及以上者，即可確診[6-7]。動(dòng)脈粥樣硬化中醫(yī)證候積分量化表參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[8]，見表1，根據(jù)中醫(yī)證候改善率評(píng)價(jià)中醫(yī)主要臨床的癥狀和體征改善狀況，應(yīng)用尼莫地平法計(jì)算中醫(yī)證候改善率，證候積分為各證候項(xiàng)下所得積分相加，依據(jù)證候改善率分為痊愈(≥95%)、顯效(≥70%且<95%)、有效(≥30%且<70%)、無效(<70%)四等級(jí)。動(dòng)脈粥樣硬化中醫(yī)診療方案中未明確病變程度的積分評(píng)價(jià)范圍。中醫(yī)證候改善率計(jì)算公式如下：

中醫(yī)證候改善率=(治療前積分 - 治療后積分)/治療前積分 × 100%。

基于上述診療標(biāo)準(zhǔn)和量化分析結(jié)果，選?、俅笫蟊碚髦笜?biāo)和行為學(xué)變化。②理化檢測(cè)指標(biāo)：血脂水平，凝血四項(xiàng)異常。血瘀證臨床指征因辯證分型不同，其診療指標(biāo)的貢獻(xiàn)度所占權(quán)重各異，寒凝所致的氣滯血瘀證凝血四項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)貢獻(xiàn)度所占權(quán)重高于血液流變學(xué)[9-10]。③病理指標(biāo)：升主動(dòng)脈和肝組織病理檢測(cè)。④以方測(cè)證作為動(dòng)脈粥樣硬化(氣滯血瘀證)診療評(píng)價(jià)指標(biāo)。

表1 動(dòng)脈粥樣硬化(氣滯血瘀證)證候積分評(píng)價(jià)量化表[8]

注：無(0)，輕度(2)，中度(4)，重度(6)。

Note. None (zero); mild (two); moderate (four); severe (six).

1.3.2 造模方法的篩選

據(jù)報(bào)道，每日冰水浴20 min，連續(xù)造模2 ～ 3周即可引起氣滯血瘀證[11]。采用脂肪乳連續(xù)灌胃兩周后可引起大鼠脂質(zhì)代謝紊亂，連續(xù)灌胃40 d后可構(gòu)建高脂血癥大鼠模型[12]。一次性大劑量免疫損傷對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病具有促進(jìn)作用[13]。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，過食肥甘會(huì)導(dǎo)致脾胃健運(yùn)失常，體內(nèi)膏脂過剩沉積，致使血脈瘀滯，濁邪內(nèi)生，血脈不利。血遇寒凝，寒氣生濁，可致氣滯血瘀，濁邪隨氣血輸布，沉積于脈道，進(jìn)一步損傷脈道。本研究結(jié)合以往文獻(xiàn)報(bào)道，主要考察免疫應(yīng)激時(shí)間和連續(xù)冰水浴時(shí)間兩因素，每個(gè)因素設(shè)定三個(gè)水平，具體為免疫應(yīng)激時(shí)間分別為第1、2、3周，連續(xù)冰水浴時(shí)間依次為2、4、6周，以血脂水平的變化、升主動(dòng)脈的病理變化為考察指標(biāo)，對(duì)造模方法進(jìn)行優(yōu)化篩選。

1.3.3 動(dòng)物分組與造模方法

將雄性Wistar大鼠按體重隨機(jī)分為四組，正常組、模型組(見優(yōu)化結(jié)果)、辛伐他汀組、通脈顆粒組，每組30只。反證藥物按體表面積比值2倍量折算成大鼠給藥劑量，辛伐他汀組0.9 mg/kg，通脈顆粒組2700 mg/kg。

正常組使用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，模型組和藥物反證組均以10 mL/kg脂肪乳(25%豬油、10%膽固醇、1%丙基硫氧嘧啶、2%脫氧膽酸鈉、25%吐溫80、20% 1,2丙二醇、17%水)進(jìn)行灌胃，每天灌胃一次，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3周后，模型組、藥物反證組大鼠分別一次性尾靜脈注射小牛血清蛋白468.75 mg/kg[14]，繼續(xù)進(jìn)行灌胃脂肪乳，與此同時(shí)，將模型組、藥物反證組大鼠分別放置在0℃ ～ 1℃冰水中20 min，一天一次，連續(xù)進(jìn)行冰水浴，造模8周后，從模型組中隨機(jī)選取3只大鼠，檢測(cè)血脂、凝血四項(xiàng)水平以及升主動(dòng)脈病理形態(tài)，進(jìn)行成模預(yù)檢測(cè)。

1.3.4 指標(biāo)觀察與檢測(cè)

(1)一般指標(biāo)觀察：觀察并記錄各組別大鼠體重變化、進(jìn)食情況及癥狀和體征的變化，攝像并留取圖片，并根據(jù)抽提指標(biāo)對(duì)各組別大鼠進(jìn)行量化評(píng)分。

(2)行為學(xué)考察：將各組別大鼠放于長、寬、高(100 cm × 100 cm × 40 cm)的曠場(chǎng)反應(yīng)箱底面中心，同步錄像并計(jì)時(shí)，觀察各組別大鼠5 min內(nèi)的活動(dòng)情況，每只拍攝結(jié)束后，及時(shí)清理箱體內(nèi)部，避免對(duì)其他大鼠造成干擾。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，記錄各組別大鼠跨過的方格數(shù)，直立次數(shù)，在中央格內(nèi)停留時(shí)間，糞便粒數(shù)。

(3)指標(biāo)檢測(cè)方法：造模成功后，按設(shè)置劑量給予辛伐他汀、通脈顆粒進(jìn)行干預(yù)，每天一次，給藥一個(gè)療程，在末次給藥之后，各組別大鼠均禁食12 h，麻醉后使用普通血清管和枸櫞酸鈉抗凝管采血，分別應(yīng)用自動(dòng)生化分析儀和血凝儀檢測(cè)血脂和凝血四項(xiàng)水平。采血結(jié)束后，摘取升主動(dòng)脈和肝組織，HE染色，觀察升主動(dòng)脈和肝組織的病理變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 造模方法的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組各組別大鼠血脂水平均顯著升高，尤其是模型7、8、9組具有極顯著性差異，見表2。升主動(dòng)脈病理結(jié)果顯示，模型1、2、3、4、5、6、7、8組升主動(dòng)脈被覆單層扁平上皮細(xì)胞，中膜較厚，主要由彈性纖維組成，外膜較薄，可見少量脂肪組織和結(jié)締組織，模型9組升主動(dòng)脈內(nèi)膜下可見少量泡沫細(xì)胞，見圖1。由此可見，在血脂異常的前提下進(jìn)行免疫應(yīng)激有助于損傷內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)，復(fù)合冰水浴刺激，進(jìn)一步促進(jìn)脂質(zhì)沉積和主動(dòng)脈的損傷。因此，本實(shí)驗(yàn)選用連續(xù)灌胃脂肪乳3周后進(jìn)行免疫應(yīng)激，同時(shí)復(fù)合冰水浴的方法進(jìn)行造模。

2.2 一般狀態(tài)觀察與證候積分變化

與正常組相比，模型組大鼠自主活動(dòng)減少，畏寒，部分大鼠舌質(zhì)紫暗，舌尖出現(xiàn)少許瘀斑，見圖2。造模干預(yù)組大鼠的證候積分前4周持續(xù)升高，8 ～ 21周之內(nèi)，造模組證候積分維持在8 ～ 12之間。21周開始給藥干預(yù)后，通脈顆粒組中醫(yī)證候改善率為45.9%，表明通脈顆?？捎行Ц纳苿?dòng)脈粥樣硬化(氣滯血瘀證)中醫(yī)癥狀和體征表現(xiàn)，辛伐他汀組無顯著性變化。大鼠中醫(yī)證候積分變化見圖3。

2.3 大鼠行為學(xué)變化

第21周對(duì)各組別大鼠進(jìn)行行為學(xué)考察，為成模檢測(cè)提供參考。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組、辛伐他汀組、通脈顆粒組大鼠跨格子數(shù)、直立次數(shù)、中央?yún)^(qū)停留時(shí)間非常顯著降低(P<0.01)，糞便粒數(shù)非常顯著增加(P<0.01)。提示，造模方法干預(yù)模型組、辛伐他汀組、通脈顆粒組后，大鼠自主活動(dòng)顯著降低，見表3。

表2 血脂水平變化

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the normal group,*P<0.05,**P<0.01.

注：A：模型1組；B：模型2組；C：模型3組；D：模型4組；E：模型5組；F：模型6組；G：模型7組；H：模型8組；I：模型9組。圖1 升主動(dòng)脈病理學(xué)圖片Note. A, Model group one. B, Model group two. C, Model group three. D, Model group four. E, Model group five. F, Model group six. G, Model group seven. H, Model group eight. I, Model group nine.Figure 1 Pathological changes of the rat ascending aortas

注：A1：正常組舌象；B1：模型組舌象；C1：辛伐他汀組舌象；D1：通脈顆粒組舌象。A2：正常組耳廓；B2：模型組耳廓；C2：辛伐他汀組耳廓；D2：通脈顆粒組耳廓。A3：正常組爪趾；B3：模型組爪趾；C3：辛伐他汀組爪趾；D3：通脈顆粒組爪趾。A4：正常組尾部；B4：模型組尾部；C4：辛伐他汀組尾部；D4：通脈顆粒組尾部。圖2 大鼠外觀對(duì)比Note.A1, Tongue manifestation of the normal group; B1, Tongue manifestation of the model group; C1, Tongue manifestation of the simvastatin group; D1, Tongue manifestation of the Tongmai granule group. A2, Auricle of the normal group; B2, Auricle of the model group; C2, Auricle of the simvastatin group; D2, Auricle of the Tongmai granule group. A3, Claw toe of the normal group; B3, Claw toe of the model group; C3, Claw toe of the simvastatin group; D3, Claw toe of the Tongmai granule group. A4, Tail of the normal group; B4, Tail of the model group; C4, Tail of the simvastatin group; D4, Tail of the Tongmai granule group.Figure 2 Comparison of the rat appearance

組別Groups跨格子數(shù)Number of grid crossing直立次數(shù)Times of upright standing中央?yún)^(qū)停留時(shí)間(s)Central area residence time糞便粒數(shù)Number of feces正常組Normal group110.5±10.48.8±1.010.8±1.81.8±0.9模型組Model group61.6±5.0??6.4±1.1??3.9±0.9??4.4±0.9??辛伐他汀組Simvastatin group63.1±4.4??6.6±0.7??6.7±0.9??5.3±0.7??通脈顆粒組Tongmai granule group67.3±6.8??7.5±0.9??5.8±1.3??4.1±0.6??

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the normal group,*P<0.05,**P<0.01.

2.4 體重變化

實(shí)驗(yàn)期間，正常組大鼠飲食正常，體重日漸增長。與正常組相比，造模干預(yù)各組大鼠造模期間體重降低非常顯著(P<0.01)，具體表現(xiàn)為大鼠體型消瘦，體重較輕。其中，辛伐他汀組個(gè)別大鼠體重增長相對(duì)較快，出現(xiàn)辛伐他汀組體重與模型組有所差異的情況。21周進(jìn)行反證藥物干預(yù)后，與模型組相比，藥物反證組大鼠體重顯著升高。見表4。

2.5 日食量和日水量變化

與正常組相比，造模干預(yù)各組大鼠在開始給予脂肪乳灌胃后，大鼠日食量顯著降低。第21周進(jìn)行反證藥物干預(yù)后，辛伐他汀組、通脈顆粒組大鼠日食量顯著升高，見圖4。與正常組相比，造模干預(yù)各組大鼠日進(jìn)水量顯著降低，見圖5。因成模檢測(cè)之前，對(duì)各組別大鼠進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)為全人工照明，人為設(shè)定“白天”與“黑夜”。因此，從19周開始，為調(diào)整大鼠晝夜節(jié)律，以適應(yīng)白天實(shí)驗(yàn)時(shí)間所需，對(duì)大鼠進(jìn)行為期兩周的晝夜顛倒適應(yīng)期，由于大鼠對(duì)環(huán)境變化比較敏感，導(dǎo)致各組別大鼠飲食受到影響，出現(xiàn)進(jìn)食量和飲水量顯著下降的情況。

注：N：正常對(duì)照組；M：模型組：S：辛伐他汀組；T：通脈顆粒組。圖4、圖5同。圖3 大鼠中醫(yī)證候積分變化Note. N, Normal control group. M, Model group. S, Simvastatin group. T, Tongmai granule group. The same in the Figure 4 and Figure 5.Figure 3 Changes in Traditional Chinese Medicine syndrome scores in the rats

組別Groups8周Eight weeks12周Twelve weeks16周Sixteen weeks20周Twenty weeks21周Twenty-one weeks25周Twenty-five weeks正常組Normal group329.8±21.5424.2±24.2424.2±20.5459.6±35.8463.7±35.7459.6±32.3##模型組Model group262.6±20.2??324.7±16.0??256.9±19.3??274.2±19.3??257.1±19.5??256.9±11.6??辛伐他汀組Simvastatin group267.4±18.6??322.8±14.1??274.4±24.4??269.4±31.7??275.5±24.9??372.5±24.0??##通脈顆粒組Tongmai granule group294.2±23.7??343.3±22.2??277.4±24.9??319.5±14.1??294.7±28.2??381.0±22.3??##

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

Note. Compared with the normal group,*P<0.05,**P<0.01. Compared with the model group,#P<0.05,##P<0.01.

圖4 日進(jìn)食量變化Figure 4 Changes in the rat daily appetite

2.6 生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.6.1 血脂水平結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組相比，模型組大鼠TC、TG、LDL-C水平非常顯著升高(P<0.01)，HDL-C水平非常顯著降低(P<0.01)；第21周給藥干預(yù)后，與模型組相比，通脈顆粒組大鼠TC、TG、LDL-C水平非常顯著降低(P<0.01)，HDL-C水平顯著升高(P<0.05)，辛伐他汀組TG、LDL-C水平非常顯著降低(P<0.01)，HDL-C水平顯著升高(P<0.05)，見表5。

2.6.2 凝血四項(xiàng)結(jié)果

與正常組相比，模型組凝血酶原時(shí)間顯著降低(P<0.05)，活化部分凝血酶時(shí)間非常顯著降低(P<0.01)，纖維蛋白原含量非常顯著升高(P<0.01)。第21周，藥物反證組開始進(jìn)行藥物干預(yù)，結(jié)果顯示，與模型組相比，通脈顆粒組纖維蛋白原含量降低非常顯著(P<0.01)；辛伐他汀組凝血酶原時(shí)間、活化部分凝血酶原時(shí)間顯著升高(P<0.05)，纖維蛋白原含量非常顯著降低(P<0.01)。結(jié)果表明造模干預(yù)后各組大鼠血液凝固性升高，血液循環(huán)凝滯的風(fēng)險(xiǎn)加大。通脈顆粒和辛伐他汀對(duì)大鼠的血液凝滯狀況具有不同程度的改善作用。見表6。

2.7 升主動(dòng)脈和肝組織病理結(jié)果

升主動(dòng)脈病理結(jié)果顯示，正常組升主動(dòng)脈被覆單層扁平上皮細(xì)胞，中膜較厚，主要由彈性纖維組成，外膜較薄，可見少量脂肪組織和結(jié)締組織。模型組升主動(dòng)脈內(nèi)膜脂質(zhì)沉積波及范圍較大。第21周給予反證藥物干預(yù)后，與模型組相比，辛伐他汀組和通脈顆粒組升主動(dòng)脈內(nèi)膜病變得到逆轉(zhuǎn)。肝病理結(jié)果顯示，正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)大小一致，中央靜脈周圍的肝細(xì)胞索呈放射狀排列，肝細(xì)胞呈多邊形，胞漿豐富，核大而圓，位于中央。模型組大鼠肝細(xì)胞空泡變性。藥物反證組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞未見壞死、變性。見圖6。

圖5 日進(jìn)水量變化Figure 5 Changes in daily water intake of the rats

組別Groups甘油三酯TG總膽固醇TC高密度脂蛋白HDL-C低密度脂蛋白LDL-C正常組Normal group0.69±0.08##2.40±0.27##0.51±0.05##0.84±0.06##模型組Model group1.27±0.06??10.20±1.06??0.33±0.07??2.06±0.41??辛伐他汀組Simvastatin group0.95±0.90??##9.00±1.46??0.30±0.06??#1.06±0.10??##通脈顆粒組Tongmai granule group0.81±0.05??##5.90±1.22?##0.41±0.07#0.96±0.10?##

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

Note. Compared with the normal group,*P<0.05,**P<0.01. Compared with the model group,#P<0.05,##P<0.01.

表6 凝血四項(xiàng)結(jié)果

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

Note. Compared with the normal group,*P<0.05,**P<0.01. Compared with the model group,#P<0.05,##P<0.01.

注：A1：正常組升主動(dòng)脈；B1：模型組升主動(dòng)脈；C1：辛伐他汀組升主動(dòng)脈；D1：通脈顆粒組升主動(dòng)脈。A2：正常組肝組織；B2：模型組肝組織；C2：辛伐他汀組肝組織；D2：通脈顆粒組肝組織。箭頭標(biāo)示升主動(dòng)脈內(nèi)膜的病變部位。圖6 升主動(dòng)脈和肝組織病理學(xué)圖片Note. A1, Ascending aorta of the normal group; B1, Ascending aorta of the model group; C1, Ascending aorta of the simvastatin group; D1, Ascending aorta of the Tongmai granule group. A2, Hepatic tissue of the normal group; B2, Hepatic tissue of the model group; C2, Hepatic tissue of the simvastatin group; D2, Hepatic tissue of the Tongmai granule group. Arrow indicates the lesion site of ascending aortic intima.Figure 6 Pathological changes of the rats ascending aorta and hepatic tissues

3 討論

內(nèi)皮細(xì)胞損傷和血脂異常是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的始動(dòng)因素[2]，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷可促成脂質(zhì)沉積和泡沫細(xì)胞的形成，開啟發(fā)病進(jìn)程[15]。中醫(yī)記載，膏脂粘滯，易沉積于脈道，致氣血運(yùn)行阻滯，脂濁沉積，滲于脈膜，可致動(dòng)脈粥樣硬化[16]。氣滯血瘀，引生脂濁，血濁氣滯而凝聚，氣、血、瘀互結(jié)交織，相互影響[17]，進(jìn)而加重動(dòng)脈粥樣硬化病變。基于此，本研究構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化(氣滯血瘀證)以血脂異常為基礎(chǔ)，以內(nèi)皮損傷為關(guān)鍵環(huán)節(jié)，輔以寒凝氣滯，構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化(氣滯血瘀證)病證結(jié)合模型。

目前，動(dòng)脈粥樣硬化病證結(jié)合模型的研究僅限于痰瘀阻絡(luò)型、穢濁痰阻型、氣陰兩虛型。痰瘀阻絡(luò)型AS模型以高脂飼喂構(gòu)建，以血脂水平和主動(dòng)脈病理指標(biāo)評(píng)價(jià)[4]，評(píng)價(jià)指標(biāo)僅限于血脂指標(biāo)和升主動(dòng)脈病理檢測(cè)。古麗加瑪力·尼亞孜等[5]利用AS發(fā)病與寒燥環(huán)境、高脂飲食習(xí)慣的關(guān)系構(gòu)建穢濁痰阻型AS模型。氣陰兩虛型AS模型則利用中老年大鼠長期慢性饑餓、竭力游泳的方法構(gòu)建。相比于上述幾種模型構(gòu)建方法和評(píng)價(jià)指標(biāo)，本研究選用尾靜脈注射牛血清蛋白、灌胃脂肪乳和冰水浴三種方法復(fù)合作用制備動(dòng)脈粥樣硬化(氣滯血瘀)大鼠模型。除病理學(xué)形態(tài)和生化指標(biāo)檢測(cè)外，本研究在參考?xì)鉁鲎C、動(dòng)脈粥樣硬化主、次證表現(xiàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)模型大鼠的生物表征進(jìn)行量化評(píng)分，基于中醫(yī)“心主血脈，貴在流通”思想，心氣盛則脈絡(luò)疏通而條達(dá)，心主血脈功能出現(xiàn)異常，致使臟腑失于濡養(yǎng)，終致血脈損傷[18-19]。通過行為學(xué)(曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn))考察反映大鼠心功能狀況，輔助模型的成模判斷。分別從中醫(yī)“四診”信息、行為學(xué)考察、病理學(xué)形態(tài)、生化指標(biāo)檢測(cè)四個(gè)方面評(píng)價(jià)動(dòng)脈粥樣硬化(氣滯血瘀證)大鼠模型。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠癥狀和體征變化情況與擬定診斷標(biāo)準(zhǔn)基本一致。日進(jìn)食量、日進(jìn)水量減少，體型消瘦。灌胃脂肪乳導(dǎo)致大鼠脂質(zhì)代謝異常，體內(nèi)血脂水平升高，為內(nèi)皮細(xì)胞脂質(zhì)的沉積奠定基礎(chǔ)。凝血四項(xiàng)指標(biāo)顯示血液凝固性升高，纖溶性降低，提示血液循環(huán)瘀滯風(fēng)險(xiǎn)增大。病理檢測(cè)顯示，模型組升主動(dòng)脈內(nèi)膜下泡沫細(xì)胞可見，出現(xiàn)不同程度的脂質(zhì)沉積。反證藥物干預(yù)后，大鼠的癥狀和體征得到不同程度改善，大鼠自主活動(dòng)逐漸恢復(fù)，血液生化指標(biāo)顯著改善，升主動(dòng)脈病變被逆轉(zhuǎn)。與此同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)大鼠證候積分、日進(jìn)食量、日進(jìn)水量曲線變化出現(xiàn)波動(dòng)，究其原因，這主要與灌胃脂肪乳、冰水浴、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)操作對(duì)大鼠的影響有關(guān)。結(jié)合動(dòng)脈粥樣硬化(氣滯血瘀證)診療指南和動(dòng)脈粥樣硬化中醫(yī)診療方案，以上三個(gè)表征指標(biāo)的曲線變化趨勢(shì)與大鼠臨床癥狀表現(xiàn)相符，造模方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的信度影響尚可接受。另外，舌診指標(biāo)對(duì)氣滯血瘀證臨床診斷具有重要價(jià)值。中醫(yī)認(rèn)為，舌尖主病。舌尖青紫或有瘀斑，主血瘀病證[20]。氣滯血瘀所致病多見舌質(zhì)紫暗、舌尖有紫點(diǎn)或紫斑[21]。如今，中醫(yī)舌象定量化、客觀化研究取得長足進(jìn)步，翁維良等[22]運(yùn)用中醫(yī)舌診專家系統(tǒng)對(duì)血瘀證進(jìn)行量化診斷，對(duì)血瘀證舌質(zhì)的RGB值進(jìn)行測(cè)定，舌質(zhì)紅色分量R值以暗紅最高，綠色分量G值以紫紅最高，藍(lán)色分量B值以紫紅、暗紅較高。這與血瘀證的一般觀察以紫暗、青紫為主相符。另外，血瘀證者較非血瘀者的瘀斑或瘀點(diǎn)出現(xiàn)率顯著升高，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[23]。方小燕等[24]將14種舌象進(jìn)行聚類分析，其中第三類舌紅或紫暗，瘀斑與氣滯血瘀證舌象特點(diǎn)相符。梁耀月等[25]通過色度檢測(cè)、分析，發(fā)現(xiàn)氣滯血瘀證大鼠舌象有紫暗、瘀斑。本研究對(duì)大鼠舌象的一般觀察亦發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)舌質(zhì)紫暗、舌尖瘀斑的表征變化，這與上述研究結(jié)果相吻合。對(duì)于其他表征指標(biāo)，如外耳、足趾及尾的證候表現(xiàn)目前以一般觀察為主，尚無客觀定量研究。

動(dòng)脈粥樣硬化(氣滯血瘀證)大鼠模型相比于動(dòng)脈粥樣硬化其他病證結(jié)合模型具有以下優(yōu)點(diǎn)：①成模均勻，本研究采用灌胃脂肪乳的方法替代飼喂高脂飼料，可保證高脂攝入量均一，提高成模的均勻性。②相比于球囊導(dǎo)管局部損傷法，免疫應(yīng)激所造成的內(nèi)皮細(xì)胞損傷部位不固定。③與動(dòng)脈粥樣硬化(氣滯血瘀證)臨床表現(xiàn)基本一致。制備方法基于內(nèi)皮細(xì)胞損傷和血脂異常這一公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制，并結(jié)合AS、氣滯血瘀證的病因病機(jī)。所構(gòu)建模型與動(dòng)脈粥樣硬化(氣滯血瘀證)臨床鑒別、診斷結(jié)果相符，能較真實(shí)地反映動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病過程的復(fù)雜性。同時(shí)，該方法也存在一些缺點(diǎn)，如造模時(shí)間較長，操作較為繁雜，工作量較大等?；谏鲜龇治?，免疫應(yīng)激、冰水浴結(jié)合脂肪乳灌胃復(fù)合方法可使動(dòng)脈粥樣硬化(氣滯血瘀證)病證同塑，為相應(yīng)藥物的藥效作用和機(jī)制研究提供評(píng)價(jià)載體。