王勇，李玉玲，蘇來曼·艾則孜，孫鋒，伍國紅，駱強(qiáng)偉*

（新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所，新疆鄯善 838200）

葡萄是種植廣泛的重要果樹之一。目前，全世界保存的葡萄資源約5000～15 000個(gè)品種[1]。這些品種主要通過雜交、實(shí)生選種、芽變、誘變等方法獲得[2]。雜交育種是葡萄育種的重要途徑，這種方式是在人工控制下，通過兩個(gè)不同基因型品種的配子結(jié)合而獲得新品種[3]。開展葡萄雜交遺傳情況研究，從微觀角度開展遺傳分析，有助于更好地指導(dǎo)葡萄雜交組合選配，把握育種方向，提高育種效率。

SSR標(biāo)記（Simple Sequence Repeats Maker）是一類由幾個(gè)核苷酸（一般為1～6個(gè)）為重復(fù)單位組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列。這些簡(jiǎn)單重復(fù)序列均勻、隨機(jī)，廣泛地分布于真核生物的基因組上，具有數(shù)量豐富、多態(tài)性、高信息量、多等位基因、共顯性等特點(diǎn)，被廣泛用于遺傳圖譜的構(gòu)建[4]、目標(biāo)基因的標(biāo)定[5]、指紋圖的繪制[6]等研究中。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

試驗(yàn)于2016年3月至2018年12月在新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所完成。

1.2 試驗(yàn)材料

新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所育種材料資源圃7年生歐亞種的‘新郁’葡萄和‘無核白雞心’葡萄及‘新郁（♀）×無核白雞心（♂）’5年生雜交群體62株雜交單株，詳見表1。

1.3 試驗(yàn)方法

表1 試驗(yàn)材料Table 1 Test materials

表2 特異性引物序列Table 2 Specific primer sequences

1.3.1 引物序列（表2）

1.3.2 樣品基因組DNA的提取

采用改良的CTAB法[7]提取葡萄葉片的基因組DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)提取的基因組DNA的片段長(zhǎng)度、濃度和純度；通過分光光度計(jì)測(cè)定并計(jì)算DNA溶液的OD260/OD280、OD260/OD230值，若前者值在1.60～1.90，后者值＞2.0可用于PCR擴(kuò)增。

1.3.3 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序

使用PCR反應(yīng)體系為：PCR MiX混合液（ng/μL）10 μL，SSR雙引物混合液（ng/μL）0.8 μL，模板（20 ng/μL）2.0 μL，ddH2O 7.2 μL，總反應(yīng)體系為20 μL，PTC-100型PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。

擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，45～65 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后一個(gè)循環(huán)72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。在操作中根據(jù)各引物差異進(jìn)行體系優(yōu)化。

1.3.4 PCR產(chǎn)物的電泳分離

（3）上?！翱鞓?0分”。上海目前93%的公辦小學(xué)已提供晚托服務(wù)，開設(shè)了“快樂30分”綜合活動(dòng)和看護(hù)服務(wù)兩項(xiàng)內(nèi)容。長(zhǎng)寧區(qū)已實(shí)現(xiàn)晚托服務(wù)公民辦小學(xué)全覆蓋；嘉定區(qū)則把為學(xué)生積淀人文素養(yǎng)、強(qiáng)健體魄和培育特長(zhǎng)相融合，99.29%的家長(zhǎng)對(duì)此表示滿意，30%的孩子已經(jīng)由原先學(xué)費(fèi)高昂的培訓(xùn)學(xué)?！盎亓鳌钡綄W(xué)校。

采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。制膠加入ddH2O 40 mL，10×TBE 4 mL，40%Acr-Bis 8 mL，TENMED 40 μL，10%APS 400 μL，在電磁攪拌器上攪拌均勻后，搖勻后迅速倒入凝膠槽中，若有氣泡，將氣泡趕到邊上，迅速裝好梳子。待凝膠完全凝固后，將凝膠槽安放于電泳槽中，加入足夠量的0.5×TBE于電泳槽中，輕輕拔下梳子，使電泳槽中緩沖液覆蓋凝膠。

準(zhǔn)備DNA樣品液：在點(diǎn)樣板各小坑中，加PCR產(chǎn)物約5 μL，均勻點(diǎn)樣。每排第一個(gè)點(diǎn)樣孔點(diǎn)一個(gè)PCR Marker作為分子量標(biāo)記，接好電泳儀的正負(fù)極，樣品池應(yīng)連接負(fù)極，打開電源進(jìn)行電泳。約3 h，指示劑遷移到一定距離時(shí)，結(jié)束電泳。置凝膠于LED發(fā)光箱下，觀察分離的DNA條帶，照相。

1.3.5 PCR產(chǎn)物的電泳分離

在電腦上對(duì)凝膠電泳圖片進(jìn)行分析，每張圖片上，第一個(gè)泳道是分子量標(biāo)記PCR Marker，第二個(gè)是母本，第三個(gè)是父本。通過Marker找到目的條帶所處的大致位置，進(jìn)而找到父本泳道的特異條帶，然后與后面的各株對(duì)應(yīng)的泳道進(jìn)行比較，觀察那些泳道出現(xiàn)與目的帶在一條線上的條帶，記下這些單株。

表3 ‘新郁’與‘無核白雞心’之間6對(duì)多態(tài)性特異引物的多態(tài)性與父本特異性Table 3 Polymorphism and paternity specificity of six pairs of polymorphic specific primers between 'Xinyu' and 'Centennial Seedless'

表4 引物Vchr4a對(duì)‘新郁’與‘無核白雞心’雜交群體遺傳多態(tài)性與特異性檢測(cè)情況Table 4 Detection of genetic polymorphism and specificity of 'Xinyu' and 'Centennial Seedless' hybrids by primer Vchr4a

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 2對(duì)SSR標(biāo)記引物對(duì)‘新郁’與‘無核白雞心’葡萄的擴(kuò)增結(jié)果

利用葡萄SSR標(biāo)記引物Vchr4a和Vchr15a分別對(duì)‘新郁’與‘無核白雞心’進(jìn)行了PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)，分析結(jié)果見表3。引物Vchr4a在‘新郁’與‘無核白雞心’之間擴(kuò)增出了6條多態(tài)性條帶，其中4條是在‘新郁’上擴(kuò)增的，2條是在‘無核白雞心’上擴(kuò)增的，且條帶長(zhǎng)度在100～200 bp，根據(jù)條帶大小順序編號(hào)為m1、m2、m3、m4、m5、m6。m2和m4是‘無核白雞心’所具有，視為特異條帶。引物Vchr15a在‘新郁’與‘無核白雞心’之間擴(kuò)增出了5條多態(tài)性條帶，其中3條是在‘新郁’上擴(kuò)增的，2條是在‘無核白雞心’上擴(kuò)增的，且條帶長(zhǎng)度在100～200 bp，根據(jù)條帶大小順序編號(hào)為n1、n2、n3、n4、n5。n1和n3是‘無核白雞心’所具有，視為特異條帶。

2.2 SSR特異引物Vchr4a對(duì)‘新郁×無核白雞心’雜交群體的擴(kuò)增

利用葡萄SSR標(biāo)記引物Vchr4a對(duì)62株‘新郁×無核白雞心’雜交組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)，結(jié)果見表4和圖1。引物Vchr4a在親本‘新郁’與‘無核白雞心’之間擴(kuò)增的6條多態(tài)性條帶，在‘新郁×無核白雞心’F1代的遺傳上表現(xiàn)為7種類型。m1+m3+m4+m5+m6型最多為29個(gè)，占46.78%；其次為m3+m5型為18個(gè)，占29.03%。母本‘新郁’所具有的4條條帶分布于整個(gè)群體。父本‘無核白雞心’具有的2個(gè)條帶與母本‘新郁’所具有的4個(gè)條帶組合表現(xiàn)為5種類，共分布于41個(gè)單株中。這說明引物Vchr4a所標(biāo)記的基因，就‘新郁’而言，遺傳給后代的能力強(qiáng)。該標(biāo)記至少能確定群體中41個(gè)單株是‘無核白雞心’的雜種。

圖1 引物Vchr4a對(duì)‘新郁×無核白雞心’雜交組合的擴(kuò)增結(jié)果Figure 1 Amplification results of primer Vchr4a in 'Xinyu×Centennial Seedless' hybrid combinations

2.3 SSR特異引物Vchr15a對(duì)‘新郁×無核白雞心’雜交群體的擴(kuò)增

利用葡萄SSR標(biāo)記引物Vchr15a對(duì)62株‘新郁×無核白雞心’雜交組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)，結(jié)果見表5和圖2。引物Vchr15a在親本‘新郁’與‘無核白雞心’之間擴(kuò)增的5條多態(tài)性條帶，在‘新郁×無核白雞心’F1代的遺傳上表現(xiàn)為4種類型。n2+n4型最多為48個(gè)，占77.42%，其次為n3+n5型為12個(gè)，占19.35%。母本‘新郁’所具有的3個(gè)條帶分布于整個(gè)群體。父本‘無核白雞心’具有的2個(gè)條帶與母本‘新郁’具有4個(gè)條帶組合表現(xiàn)為3種類，共分布于14個(gè)單株中。這說明引物Vchr15a所標(biāo)記的基因，就‘新郁’而言，遺傳給后代的能力也很強(qiáng)。該標(biāo)記至少能確定群體中14個(gè)單株是‘無核白雞心’的雜種。

圖2 引物Vchr15a對(duì)‘新郁×無核白雞心’雜交組合的擴(kuò)增結(jié)果Figure 2 Amplification results of primer Vchr15a in 'Xinyu×Centennial Seedless' hybrid combinations

3 討論與結(jié)論

分子標(biāo)記技術(shù)是一種以DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)，通過檢測(cè)DNA分子由于缺失、插入、易位、倒位、重排或存在長(zhǎng)短與排列不一的重復(fù)序列等機(jī)制而產(chǎn)生多態(tài)性的技術(shù)。該技術(shù)不受環(huán)境因素及發(fā)育階段的影響，具有快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、可靠、穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，特別是SSR標(biāo)記技術(shù)因具有較好的穩(wěn)定性和多態(tài)性，在葡萄的分子標(biāo)記輔助育種中應(yīng)用的比較廣泛。Thomas等[8]、Bowers等[9-10]、Sefc等[11]相繼開發(fā)了9個(gè)適合葡萄品種鑒定的SSR引物：VVS2、VVMD5、VVMD7、VVMD32、VVMD28、VVMD27、VVMD25、VrZAG79、VrZAG62。在國際上，法國、德國、意大利等利用該9對(duì)引物建立了葡萄品種分子數(shù)據(jù)庫（www.vivc.de），在線為葡萄科研工作者提供查詢服務(wù)，為國際上葡萄品種的鑒定與交換奠定了基礎(chǔ)。但遺憾的是，該數(shù)據(jù)庫中不包含中國育成品種。目前，在葡萄基因組上已經(jīng)定位了753個(gè)SSR標(biāo)記[12]，這為葡萄雜交真?zhèn)涡澡b別提供了理論依據(jù)。李貝貝等[13]利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)314份葡萄品種進(jìn)行了DNA指紋數(shù)據(jù)庫構(gòu)建和遺傳多樣性分析。樊秀彩等[14]以山葡萄、河岸葡萄以及239株二者的雜交后代為材料，利用SSR引物作為雜種鑒定的標(biāo)記，進(jìn)行了有效地葡萄屬種間雜種真?zhèn)涡澡b定。憲立杰等[15]利用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)45個(gè)葡萄品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析，并建立了葡萄品種SSR基因型指紋庫。杜晶晶[16]應(yīng)用9對(duì)SSR引物構(gòu)建了80份葡萄種質(zhì)的有效分子身份證。郭春苗等[17]利用4條SSR標(biāo)記引物構(gòu)建了新疆44個(gè)適宜制干葡萄品種DNA指紋圖譜。在此基礎(chǔ)上，本文從中選擇2對(duì)標(biāo)記開展‘新郁’與‘無核白雞心’基因測(cè)定，研究定位基因遺傳情況，進(jìn)一步完善分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)，為自育葡萄雜交真?zhèn)涡澡b定和指紋圖譜構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

本文認(rèn)為，兩個(gè)SSR引物所標(biāo)記的母本‘新郁’的遺傳物質(zhì)能夠在雜交群體中普遍遺傳，父本‘無核白雞心’的遺傳物質(zhì)在雜交群體中表現(xiàn)為部分遺傳。SSR標(biāo)記引物Vchr4a與Vchr15a可以用來鑒定該組合的雜交真?zhèn)涡?，Vchr4a所標(biāo)記的基因比Vchr15a標(biāo)記的遺傳能力強(qiáng)。但葡萄是具有高度雜合基因的多年生植物，單靠1條或2對(duì)引物不能完成群體的雜交真?zhèn)涡澡b定。