夏先學(xué)，陳 路，蔚 芃

川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科四川南充637000

骨肉瘤是兒童和青少年最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，具有高度侵襲性和早期全身轉(zhuǎn)移的特征［1］。近些年已發(fā)現(xiàn)一些分子靶點可明顯改善骨肉瘤患者臨床治療效果，但仍需尋找更多有效靶點。FOS樣抗原2(Fos-related antigen 2，F(xiàn)OSL2)是FOS基因家族成員之一，與Jun亞家族均屬于激活蛋白-1轉(zhuǎn)錄因子家族，與細(xì)胞生長、侵襲和轉(zhuǎn)移、黏附、運動等有關(guān)［2］。多種腫瘤組織內(nèi)FOSL2表達明顯高于相鄰正常組織。FOSL2可通過與Smad3相互作用促進TGF-β1誘導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌遷移［3］;miR-597 靶向FOSL2可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移［4］;miR-143-3p靶向FOSL2可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移［5］。本研究通過RNAi技術(shù)沉默人骨肉瘤細(xì)胞MG63細(xì)胞中FOSL2表達，旨在探討沉默F(xiàn)OSL2表達對骨肉瘤細(xì)胞生長的影響及其機制。

1 材料與方法

1．1 細(xì)胞、試劑和儀器 人骨肉瘤MG63細(xì)胞株購自美國ATCC。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國HyClone;Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司;CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所;Annexin V-FITC/PI檢測試劑盒購自南京Keygen公司;FOSL2、PCNA、MMP-2和Bax抗體均購自美國Abcam公司;Transwell小室購自美國Costar公司;酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司;流式細(xì)胞儀購自德國Eppendorf公司。

1．2 標(biāo)本來源 收集川北醫(yī)學(xué)院保存的2016年6月至2018年8月行骨肉瘤穿刺和活檢存檔的骨肉瘤及相應(yīng)的肉瘤旁正常組織標(biāo)本，患者中男26例，女16例，年齡8～53歲，中位年齡20歲。所有患者術(shù)前均未行放療及化療。

1．3 細(xì)胞培養(yǎng)及siRNA轉(zhuǎn)染 MG63細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后，用DMEM/F12完全培養(yǎng)基，于體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱常規(guī)傳代培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染參照Lipofectamine2000說明。以5×105個/孔密度將生長至對數(shù)期的MG63細(xì)胞接種于6孔板，每孔2 mL，細(xì)胞達30%～50%的生長密度時轉(zhuǎn)染。細(xì)胞分為空白對照組(加生理鹽水)、陰性對照組(NC，轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA)和siFOSL2-siRNA組(轉(zhuǎn)染FOSL2 siRNA)。制備siRNA和Lipofectamine2000混合液，使siRNA終濃度為100 nmol/L，將混合液加入細(xì)胞，于體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃恒溫條件下轉(zhuǎn)染4～6 h，換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1．4 FOSL2、PCNA、MM P-2 和 Bax蛋白的 W estern blot檢測 組織標(biāo)本液氮冷凍狀態(tài)下研磨后或取轉(zhuǎn)染48 h的MG63細(xì)胞，加入適量RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。按照40μg/孔上樣蛋白，經(jīng)SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉后洗膜。PE手套自制雜交袋，將膜放入袋中，加入稀釋好的一抗(FOSL2、PCNA、MMP-2 和 Bax皆按照1∶500稀釋)，室溫?fù)u床孵育2 h，棄一抗，TBST洗膜，在雜交袋中加入按照1∶3 000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗，室溫?fù)u床孵育2 h，TBST洗膜，ECL顯色。Quantity-One軟件分析蛋白條帶灰度值。目的蛋白的相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。實驗重復(fù)3次。

1．5 細(xì)胞增殖實驗 使用CCK-8試劑盒檢測。選擇轉(zhuǎn)染24 h后生長穩(wěn)定的骨肉瘤細(xì)胞，以1×104個/孔接種于96孔板，每組設(shè)置5個復(fù)孔。每孔加10μL CCK-8試劑，在體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度、37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于24、48、72和96 h通過酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞490 nm波長下的吸光度(A)值。實驗重復(fù)3次。

1．6 細(xì)胞凋亡實驗 取轉(zhuǎn)染48 h后生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，棄上清，PBS漂洗2次，加1～2 mL胰蛋白酶消化細(xì)胞使之脫壁，靜置5～8 min，輕搖使之形成均勻的細(xì)胞懸液，含鈣離子的結(jié)合緩沖液終止消化，分別加Annexin V-FITC和PI各5μL，輕搖混勻，再加入結(jié)合緩沖液350μL，混勻，常溫避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測。實驗重復(fù)3次。

1．7 細(xì)胞侵襲和遷移實驗 Transwell小室上室加入50μL稀釋好的Matrigel膠，十字搖勻，于37℃培養(yǎng)箱放置40 min。接種轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞(3×104個/孔)至Transwell小室的上室，每組設(shè)置5個復(fù)孔，在上室加100μL無血清培養(yǎng)基，下室加500 μL含血清培養(yǎng)基，37℃密閉培養(yǎng)12 h，取出培養(yǎng)板，結(jié)晶紫染色30 min，PBS漂洗2遍，棉簽擦拭掉上層未穿過基底膜的細(xì)胞，光鏡下選擇5個視野(×200)，拍照記錄并進行穿膜細(xì)胞計數(shù)。實驗重復(fù)3次。遷移實驗除了未鋪Matrigel膠，其他操作同細(xì)胞侵襲實驗。

1．8 MG63細(xì)胞PCNA、MMP-2和 Bax m RNA 表達的qRT-PCR檢測 總RNA提取試劑盒提取轉(zhuǎn)染48 h的MG63細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用qRT-PCR檢測細(xì)胞中PCNA、MMP-2和Bax mRNA的表達。所有引物由上海生工設(shè)計合成。PCR反應(yīng)體系20μL，其中SYBR Premix Ex Tap 10 μL，上下游引物各0．4 μL，模板 cDNA 2 μL，ddH2O 7．2 μL。反應(yīng)條件95 ℃30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 個循環(huán);65 ℃延長5 min。每個樣品設(shè)置3個重復(fù)，采用2－ΔΔCt法對數(shù)據(jù)進行相對定量分析，取均值。

1．9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21．0進行分析，骨肉瘤和肉瘤旁正常組織FOSL2蛋白表達，采用配對t檢驗，各組細(xì)胞增殖、凋亡，侵襲和遷移的差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采SNK-q檢驗，檢驗水準(zhǔn) α =0．05。

2 結(jié)果

2．1 骨肉瘤和肉瘤旁正常組織中FOSL2蛋白的表達 42例骨肉瘤和肉瘤旁正常組織中FOSL2蛋白的相對表達量分別為(0．554±0．049)和(0．114±0．012)，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t配對=15．107，P ＜0．001)，結(jié)果見圖1。

圖1 兩種組織FOSL2蛋白的表達

2．2 各組 MG63細(xì)胞 FOSL2蛋白的表達FOSL2-siRNA組MG63細(xì)胞中FOSL2蛋白表達水平明顯降低(P ＜0．05)，結(jié)果見圖2、表1。

圖2 各組MG63細(xì)胞中FOSL2蛋白的表達

表1 各組MG63細(xì)胞FOSL2蛋白相對表達量比較

2．3 各組MG63細(xì)胞增殖情況比較 結(jié)果見表2。

表2 各組細(xì)胞增殖A值比較(n=3)

2．4 各組MG63細(xì)胞凋亡率、侵襲和遷移能力的比較 結(jié)果見表3。

表3 各組MG63細(xì)胞凋亡率、侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)的比較(n=3)

2．5 各組MG63細(xì)胞中PCNA、MMP-2和Bax的蛋白表達 結(jié)果見圖3和表4、5。

圖3 各組MG63細(xì)胞PCNA、MMP-2和Bax蛋白的表達

表4 各組MG63細(xì)胞中PCNA、MMP-2和Bax m RNA的表達(n=3)

表5 各組MG63細(xì)胞中PCNA、MM P-2和Bax蛋白的表達(n=3)

3 討論

近些年分子靶向治療在腫瘤治療中成為研究熱點。FOSL2基因定位于人類2號染色體，在脂肪代謝、骨發(fā)育、系統(tǒng)硬化癥、癌癥等疾病中均發(fā)揮重要作用［6］。皮膚T淋巴細(xì)胞瘤中FOSL2表達量極高，RNAi技術(shù)介導(dǎo)的FOSL2敲除可抑制癌細(xì)胞的生長及CCR4和 MYB等致癌基因的表達［7］。已有研究［5］表明miR-143-3p可靶向FOSL2抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。本研究結(jié)果顯示，抑制FOSL2表達后骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力明顯降低，且凋亡率明顯升高，提示FOSL2在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。

PCNA是一種可反映細(xì)胞增殖程度的理想指標(biāo)，其表達水平可客觀反映腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)［8］。有研究［9-10］證實，PCNA 高表達的骨肉瘤患者臨床預(yù)后差。MMP是一類重要的蛋白酶類，與腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，MMP-2是MMP家族成員之一。有研究［11］顯示，MMP-2在骨肉瘤等多種腫瘤中表達升高，可促進腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Bax是與凋亡相關(guān)的Bcl-2家族成員之一，多項研究［12-13］表明，Bax表達上調(diào)對骨肉瘤細(xì)胞凋亡起促進作用。本研究結(jié)果顯示，抑制FOSL2表達的骨肉瘤細(xì)胞中PCNA和MMP-2表達明顯降低，Bax表達明顯升高，提示FOSL2對骨肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡影響與調(diào)控 PCNA、MMP-2和 Bax表達有關(guān)。

綜上所述，F(xiàn)OSL2與骨肉瘤細(xì)胞活力、侵襲和遷移能力關(guān)系密切，機制與下調(diào)PCNA、MMP-2表達及上調(diào)Bax表達有關(guān)。