王 蕾，任凱凱，馬佳康，陳小華，張萌迪，李丹丹，李曉娜，馬 軍

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化疾病研究所鄭州450014 2)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科鄭州450014 3)漯河市中心醫(yī)院消化內(nèi)科河南漯河426499 4)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院放射科鄭州450014 5)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科鄭州450014

胃癌的發(fā)生、發(fā)展與遺傳、環(huán)境及細(xì)菌感染有關(guān)，據(jù)2018年報(bào)道的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，全球胃癌分別位于惡性腫瘤發(fā)病率的第5位、死亡率的第2位，提示胃癌的惡性程度較高且預(yù)后不佳［1］。胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一。通過更多的分子特征的研究，有助于了解胃癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，探索更為有效地診療靶點(diǎn)。近幾年來，非編碼RNA的功能逐漸被大家所認(rèn)識(shí)，包括長鏈非編碼RNA(lncRNA)和微小RNA(miRNA)等。miRNA是一類長為21～23個(gè)核苷酸的非編碼小RNA分子，通過基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控與抑制靶基因的表達(dá)等途徑來發(fā)揮作用。lncRNA又可作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(ceRNA)調(diào)控相關(guān)miRNA的功能，形成細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。文獻(xiàn)［2-5］報(bào)道，有300余個(gè)miRNA和胃癌有關(guān)，其中miR-204-5p在胃癌中低表達(dá)，和胃癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了胃腺癌ceRNA網(wǎng)絡(luò)，分析重要節(jié)點(diǎn)基因 miR-204-5p及其靶基因HOXC8在胃腺癌中的表達(dá)情況，為研究胃腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 TCGA數(shù)據(jù)分析和ceRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 從TCGA 數(shù)據(jù)庫(https://cancergenome．nih．gov/)中下載胃腺癌 mRNA和 miRNA測(cè)序數(shù)據(jù)(版本2018．2．23)，使用R語言“edgeR”包篩選差異表達(dá)基因，篩選條件為差異倍數(shù)＞2且校正P值＜0．05。利用miRcode、starBase、miRDB、miRTarBase、TargetScan 等數(shù)據(jù)庫和在線工具，預(yù)測(cè)差異表達(dá)基因的靶向調(diào)節(jié)關(guān)系，構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape V3．5．1軟件進(jìn)行作圖。

1．2 病例收集 收集鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院初診初治的胃腺癌手術(shù)標(biāo)本32例，其中男23例，女9例，患者年齡(57±14)歲，均經(jīng)病理證實(shí)。同時(shí)收集癌旁正常黏膜組織(手術(shù)切緣取材，距癌組織＞5 cm，且經(jīng)病理證實(shí))。標(biāo)本液氮速冷后存于－80℃冰箱備用。

1．3 細(xì)胞系和主要試劑 胃腺癌SGC7901細(xì)胞系(ATCC)為本實(shí)驗(yàn)室保存。Trizol(15596018)、miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(G903;含加polyA尾酶)、mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(G492)均購自 Ambion公司，qRTPCR試劑為含ROX的SYBRGreen(上海羅氏制藥有限公司，04913914001)。引物和miRNA模擬物及其對(duì)照均由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)并合成(表1)，轉(zhuǎn)染試劑為銳博生物技術(shù)公司產(chǎn)品(Ribo-FECTCP)。

表1 所用引物和m iRNA序列表

1．4 胃腺癌組織中m iR-204-5p和HOXC8 m RNA表達(dá)的qRT-PCR檢測(cè) 用Trizol裂解凍存的新鮮組織，提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，紫外分光光度儀測(cè)定濃度。按試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄，然后用SYBR Green法進(jìn)行PCR，檢測(cè)miR-204-5p和HOXC8 mRNA的表達(dá)，具體實(shí)驗(yàn)方法參見試劑盒說明書。U6為檢測(cè)miR-204-5p的內(nèi)參;β-actin作為HOXC8 mRNA檢測(cè)的內(nèi)參;表達(dá)量用2－ΔΔCt計(jì)算。

1．5 m iR-204-5p模擬物轉(zhuǎn)染后SGC7901細(xì)胞中HOXC8 mRNA表達(dá)的qRT-PCR檢測(cè) SGC7901細(xì)胞接種于24孔板(2×105個(gè)/孔)，37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640，第2天細(xì)胞達(dá)70%融合時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染試劑用RioFECT，按照說明書進(jìn)行操作。miR-204-5p模擬物終濃度為50 nmol/L，每孔用轉(zhuǎn)染試劑3μL，48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)基因RNA表達(dá)量(實(shí)驗(yàn)方法同1．4)。分別用未轉(zhuǎn)染和無關(guān)序列轉(zhuǎn)染作為空白或無關(guān)對(duì)照組。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21．0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。應(yīng)用非參檢驗(yàn)(Wilcoxon)分析胃腺癌和癌旁組織中miR-204-5p和HOXC8mRNA表達(dá)水平的差異，應(yīng)用t檢驗(yàn)分析miR-204-5p模擬物轉(zhuǎn)染后SGC7901細(xì)胞中HOXC8 mRNA表達(dá)的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 胃腺癌中重要的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 從TCGA數(shù)據(jù)庫下載的胃腺癌測(cè)序數(shù)據(jù)中，剔除3個(gè)未明確顯示胃腺癌診斷的病例，共得到mRNA和ln-cRNA胃癌數(shù)據(jù)374個(gè)，正常數(shù)據(jù)32個(gè);miRNA胃癌數(shù)據(jù)443個(gè)，正常數(shù)據(jù)45個(gè)。數(shù)據(jù)合并為矩陣后，按照篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到差異表達(dá) lncRNA、miRNA和mRNA(圖 1)，并構(gòu)建了 lncRNA-miRNA-mRNA的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。圖1顯示，miR-204是重要的調(diào)控節(jié)點(diǎn)，其在胃腺癌中表達(dá)下調(diào)。經(jīng)在線預(yù)測(cè)，miR-204-5p和HOXC8基因的3’UTR區(qū)有結(jié)合位點(diǎn)，兩者有靶向調(diào)節(jié)關(guān)系(圖2)。

圖1 依據(jù)TCGA數(shù)據(jù)構(gòu)建的胃腺癌lncRNA-m iRNA-m RNA的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

圖2 m iR-204-5p和HOXC8靶向關(guān)系圖

2．2 m iR-204-5p和HOXC8 mRNA在胃腺癌組織中的表達(dá) 與癌旁正常組織組織{［(3．24(1．20，4．44)］和［1．20(0．11，1．31)］}相比，胃腺癌組織中miR-204-5p mRNA［1．9(0．34，2．25)］低表達(dá)，而HOXC8 mRNA 高表達(dá)［3．6(2．82，6．42)］(Z=3．254和4．263，P ＜0．001)。

2．3 m iR-204-5p模擬物轉(zhuǎn)染對(duì)SGC7901細(xì)胞中HOXC8 m RNA表達(dá)的影響 與無關(guān)對(duì)照組(0．955±0．137)相比，轉(zhuǎn)染 miR-204-5p 模擬物的SGC7901細(xì)胞中 HOXC8 mRNA的表達(dá)(0．505±0．078)明顯下調(diào)(t=2．864，P=0．046)。

3 討論

miRNA 最早發(fā)現(xiàn)于 1993年［6］，在核內(nèi)是由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄形成的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(pri-miRNA)，其后在核酸酶Drosha和輔助因子DGCR8/Pasha所構(gòu)成的微處理器復(fù)合體中剪切成長為60～70個(gè)核苷酸的miRNA前體(pre-miRNA)，隨后再分解為miRNA。miRNA主要存在于胞漿中，通過結(jié)合到靶基因的3’UTR區(qū);通過抑制翻譯或促進(jìn)mRNA降解，起到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因表達(dá)的作用。可以通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)miRNA的靶向mRNA。

有文獻(xiàn)［7-10］對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫中的胃癌測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并構(gòu)建了ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn) miR-204-5p是胃腺癌中重要的差異表達(dá)基因。

研究［2，5，11-13］顯示，miR-204-5p 在胃癌中低表達(dá)，有抑癌基因的作用，對(duì)胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換、侵襲和遷移有抑制作用，并促進(jìn)化療藥物療效;外周血中miR-204水平降低的胃癌患者預(yù)后較差［14］。本研究通過TCGA數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)miR-204-5p在胃腺癌中低表達(dá)，并通過檢測(cè)胃腺癌患者的癌和癌旁正常黏膜組織標(biāo)本驗(yàn)證了這一結(jié)果。

本研究通過多個(gè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)HOXC8是miR-204-5p的靶基因，目前尚無文獻(xiàn)對(duì)兩者的靶向關(guān)系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。HOXC8在多種腫瘤中高表達(dá)，作為癌基因，具有促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移、增殖等作用，但在胃腺癌中的作用尚不明確［15-17］。

本研究中生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和胃腺癌組織檢測(cè)結(jié)果均提示miR-204-5p和HOXC8存在ceRNA調(diào)控關(guān)系，胃腺癌中miR-204-5p表達(dá)下調(diào)可能會(huì)導(dǎo)致HOXC8表達(dá)上調(diào)，并通過促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移、抑制凋亡等作用機(jī)制，造成腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。因此，本研究用miR-204-5p模擬物轉(zhuǎn)染胃腺癌SGC7901細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后(48 h)可明顯抑制HOXC8mRNA的表達(dá)水平，其抑制效率達(dá)到50%左右。這些結(jié)果提示，miR-204-5p作為ceRNA，可能和HOXC8形成一個(gè)調(diào)節(jié)通路。另外，miR-211-5p和miR-204-5p有相同的結(jié)合靶點(diǎn)，但它在胃腺癌中無表達(dá)異常，該基因的功能是否和miR-204-5p有相互影響，尚需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。