梁 霄，柏小川

遵義市第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科貴州遵義563000

心血管系統(tǒng)疾病是一類危害人類生命健康的常見疾病，其中心肌細(xì)胞損傷是心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生的重要原因;缺氧復(fù)氧、酸中毒等都可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，細(xì)胞內(nèi)過量的氧自由基可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡［1］。泛醇-細(xì)胞色素C還原酶核心蛋白1(ubiquinol-cytochrome C reductase core protein 1，Uqcrc1)定位于線粒體內(nèi)膜，是一種與線粒體呼吸鏈有關(guān)的蛋白亞基，參與細(xì)胞生長、氧化應(yīng)激等過程［2］。有研究［3］表明，在心肌細(xì)胞中 Uqcrc1 具有抗缺氧復(fù)氧損傷和抗凋亡的作用;而在腫瘤細(xì)胞中的研究［4］卻顯示Uqcrc1具有抑制細(xì)胞生長、促細(xì)胞凋亡的作用。本研究用過氧化氫(H2O2)處理心肌細(xì)胞，體外構(gòu)建心肌細(xì)胞氧化損傷模型，通過感染Uqcrc1慢病毒上調(diào)心肌細(xì)胞中Uqcrc1的表達(dá)水平，探討Uqcrc1在心肌細(xì)胞氧化損傷中的作用。

1 材料與方法

1．1 主要材料 心肌H9c2細(xì)胞購自南京科佰生物科技有限公司，在體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和體積分?jǐn)?shù)90%DMEM的細(xì)胞培養(yǎng)液在飽和濕度、37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)?；罨虲aspase-3(Cleaved Caspase-3)抗體、過氧化氫酶(CAT)活性檢測(cè)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所;PCR試劑購自大連TaKaRa公司;Uqcrc1過表達(dá)慢病毒和陰性對(duì)照慢病毒均由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建;Uqcrc1抗體購自上海樊克生物科技有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性檢測(cè)試劑盒和丙二醛(MDA)含量檢測(cè)試劑盒均購自南京建成生物研究所;活化型Caspase-9(Cleaved Caspase-9)抗體購自美國 Abbkine公司;乳酸脫氫酶(LDH)含量檢測(cè)試劑盒購自沈陽萬類生物科技有限公司。

1．2 慢病毒感染及實(shí)驗(yàn)分組 將H9c2細(xì)胞接種到12孔板內(nèi)，細(xì)胞密度達(dá)40% ～50%時(shí)，分別在細(xì)胞中添加Uqcrc1過表達(dá)慢病毒和陰性對(duì)照慢病毒液(MOI=20)，繼續(xù)培養(yǎng)12 h以后，取出培養(yǎng)板，吸棄上清液，添加新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3 d以后，在熒光顯微鏡下觀察，感染效率均高于90%。病毒感染后細(xì)胞分別在200μmol/L的H2O2細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)12 h(Lv-NC+H2O2組、Lv-Uqcrc1+H2O2組)。以只用200μmol/L H2O2細(xì)胞培養(yǎng)液處理的細(xì)胞為模型對(duì)照(H2O2組)。以不感染慢病毒和不用H2O2培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞為空白對(duì)照(H9c2組)。

1．3 細(xì)胞中Uqcrc1 m RNA及蛋白表達(dá)的檢測(cè)

①qRT-PCR:用Trizol試劑分別提取細(xì)胞中的總RNA，RNA樣品A(260 nm)/A(280 nm)的比值大于1．8且小于2．0。按試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，cDNA保存在－20℃。以cDNA作為模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系:2．0 μL的 cDNA 模板，0．4 μL的引物，10．0 μL 的 PCR Master Mix，7．2 μL 雙篜水。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃ 5min，變性95℃ 15 s，退火 60℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。按照2－ΔΔCt法計(jì)算Uqcrc1表達(dá)水平。Uqcrc1上游引物序列 5’-CGGGGCAAAAACATCCTTAG-3’，下游引物序列5’-GCGGCGGCCATAAGTCAG-3’。內(nèi)參β-actin上游引物序列 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物序列5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

②Western blot:在細(xì)胞中加入含有PMSF的RIPA 裂解液［V(RIPA)∶V(PMSF)=100∶1］，于冰上裂解、12 000×g離心后，BCA法測(cè)定蛋白濃度。分別在蛋白樣品中添加1/4體積的5×上樣緩沖液，100℃變性5 min，按照每個(gè)孔內(nèi)加入40μg蛋白樣品進(jìn)行上樣，凝膠為100 g/L的下層膠和50 g/L的上層膠，設(shè)置上、下層膠電泳電壓分別為70、120 V，電泳時(shí)長共2．5 h。按照半干法于冰上進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜電流為180 mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為50 min。電轉(zhuǎn)后的NC膜用牛血清白蛋白室溫封閉約1．5 h，再依次用一抗(按1∶800稀釋)、二抗(按1∶4 000稀釋)反應(yīng)后，ECL法發(fā)光，Odyssey掃描后，以β-actin作為參照，分析Uqcrc1蛋白水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．4 各組細(xì)胞增殖的CCK-8法檢測(cè) 將4組細(xì)胞接種到96孔板內(nèi)，每孔添加100μL細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，吸棄孔內(nèi)液體，每孔添加90μL細(xì)胞培養(yǎng)液和10μL CCK-8工作液，孵育4 h以后，檢測(cè)450 nm的A值。設(shè)H9c2組細(xì)胞存活率為100%，分析其他3組細(xì)胞存活率(與H9c2組存活率的比值)的變化。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．5 各組細(xì)胞中LDH漏出率的二硝基苯肼顯色法檢測(cè) 分別檢測(cè)4組細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞中LDH水平，LDH檢測(cè)方法用二硝基苯肼顯色法，具體操作步驟參照試劑盒說明書，以培養(yǎng)液中LDH水平占總LDH水平(培養(yǎng)液和細(xì)胞中LDH水平之和)的百分比表示LDH漏出率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．6 各組細(xì)胞中 SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量檢測(cè) 分別檢測(cè)4組細(xì)胞中SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量，步驟均同試劑盒說明書，SOD檢測(cè)用黃嘌呤氧化法，CAT檢測(cè)用鉬酸銨比色法，GSH-Px檢測(cè)用ELISA法，MDA檢測(cè)用硫代巴比妥酸法。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．7 各組細(xì)胞凋亡率的雙染法檢測(cè) 用D-Hanks液將各組細(xì)胞洗滌以后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，吸取1 mL細(xì)胞懸液，用500μL的Binding Buffer重懸后，添加Annexin V-FITC 5μL，放在避光條件下孵育20 min后，再添加5μL的PI，4℃孵育5 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．8 各組細(xì)胞中 Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平檢測(cè) 用Western blot法檢測(cè)4組細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平，步驟同前，Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9一抗均按1∶600稀釋。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21．0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)比較各組細(xì)胞中Uqcrc1 mRNA和蛋白表達(dá)水平，細(xì)胞存活率和LDH漏出率，SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量，細(xì)胞凋亡率和Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 上調(diào)Uqcrc1表達(dá)對(duì)H2O2條件下H9c2細(xì)胞中Uqcrc1表達(dá)的影響 結(jié)果見表1。由表1可知，Lv-Uqcrc1+H2O2組細(xì)胞中Uqcrc1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯高于H2O2組和Lv-NC+H2O2組。

2．2 上調(diào)Uqcrc1表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷的影響 結(jié)果見表 2。由表 2可知，上調(diào)Uqcrc1的表達(dá)可抑制H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷。

2．3 上調(diào)Uqcrc1表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 結(jié)果見表3。由表3可知，上調(diào)Uqcrc1的表達(dá)可抑制H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激。

2．4 上調(diào)Uqcrc1表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡的影響 結(jié)果見表 4。由表 4可知，上調(diào)Uqcrc1的表達(dá)可抑制H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡。

表1 各組H9c2細(xì)胞中Uqcrc1 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較(n=3)

表2 各組H9c2細(xì)胞存活率和LDH漏出率比較(n=3)

表3 各組H9c2細(xì)胞中SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量(n=3)

表4 各組H9c2細(xì)胞凋亡率和Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平(n=3)

3 討論

心血管系統(tǒng)疾病是影響人類壽命和生活質(zhì)量的常見疾病，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，腎素-血管緊張素活性升高、交感神經(jīng)激活、血管內(nèi)皮組織損傷、心肌損傷等［5-7］均與其發(fā)生有關(guān)。氧化應(yīng)激是心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生的重要原因，氧化應(yīng)激能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞中LDH釋放至細(xì)胞外，檢測(cè)細(xì)胞LDH漏出率可以間接反映細(xì)胞損傷程度［8-9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H2O2處理后的心肌細(xì)胞LDH漏出率升高，細(xì)胞存活率降低，提示成功構(gòu)建了心肌細(xì)胞氧化損傷模型。

Uqcrc1是線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ上的功能亞單位，其表達(dá)變化可以直接調(diào)控線粒體功能，Uqcrc1表達(dá)下調(diào)能夠誘導(dǎo)線粒體呼吸障礙［10-11］。有研究［12］顯示，心肌損傷與線粒體損傷有關(guān)，Uqcrc1具有保護(hù)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷的作用，過表達(dá)Uqcrc1能夠減少心肌細(xì)胞凋亡，提高心肌細(xì)胞活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)Uqcrc1后的心肌細(xì)胞經(jīng)H2O2處理以后，細(xì)胞存活率升高，LDH漏出率降低，提示Uqcrc1在心肌細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護(hù)作用，可能是心肌保護(hù)的新靶點(diǎn)。

生理狀態(tài)下適量的氧自由基對(duì)于維持機(jī)體內(nèi)氧化平衡狀態(tài)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有重要意義，當(dāng)機(jī)體內(nèi)的氧自由基數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于抗氧化系統(tǒng)的清除能力時(shí)，氧自由基過量積累，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)發(fā)生過氧化，產(chǎn)生大量的 MDA［13-15］。SOD、CAT、GSH-Px 是抗氧化酶，其活性降低可以直接導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧自由基積累［16］。另外，過量的氧自由基可以激活細(xì)胞內(nèi)Caspase凋亡反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［17］。Caspase是廣泛存在于人類組織中的凋亡相關(guān)蛋白，其含有多個(gè)蛋白成員，分別在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮不同的作用，Caspase-9和Caspase-3分別位于Caspase凋亡反應(yīng)的上游和下游，正常狀態(tài)下以沒有活性的酶原形式存在，只有被激活后才可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生［18-20］。本研究結(jié)果顯示，Uqcrc1可以提高 H2O2條件下心肌細(xì)胞中抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px的活性，減少細(xì)胞中MDA的產(chǎn)生，降低細(xì)胞凋亡率，減少細(xì)胞中活化的Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)水平，提示Uqcrc1可能通過提高心肌細(xì)胞抗氧化能力，減少氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述，Uqcrc1在氧化應(yīng)激條件下的心肌細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護(hù)作用，上調(diào)Uqcrc1能夠減輕心肌細(xì)胞凋亡和氧化損傷，這對(duì)于研究Uqcrc1在心血管系統(tǒng)疾病中的作用具有重要意義，本研究為Uqcrc1治療心肌損傷提供了參考。作者將在以后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究Uqcrc1在缺氧復(fù)氧、高糖等引起的心肌細(xì)胞損傷中的作用。