吳丹榮，李 紅，王 超，高方友

1)貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌及代謝病科貴陽(yáng)550004 2)貴州醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院神經(jīng)外科貴陽(yáng)550002

垂體瘤是一種顱內(nèi)良性腫瘤，前葉的腺瘤是較為常見(jiàn)的類(lèi)型，而侵襲性垂體腺瘤約占垂體腺瘤的10%［1］，具有術(shù)后效果差和復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)。生長(zhǎng)分化 因 子 15(growth differentiation factor 15，GDF15)又稱(chēng)巨噬細(xì)胞抑制因子、胎盤(pán)骨形態(tài)發(fā)生蛋白、胎盤(pán)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子和前列腺衍生因子，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族成員，在調(diào)節(jié)組織發(fā)育、免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［2-3］。大量研究［4-6］證實(shí)，GDF15在子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌和乳腺癌等多種腫瘤組織或細(xì)胞中異常表達(dá)，在細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。近年來(lái)，有研究［7］發(fā)現(xiàn)GDF15在垂體腺瘤中高表達(dá)，且與垂體瘤侵襲性有關(guān)，但其機(jī)制并不清楚。本研究將GDF15-siRNA轉(zhuǎn)染至人泌乳素型垂體瘤細(xì)胞HPAs中干擾GDF15表達(dá)，觀察其對(duì)垂體瘤細(xì)胞增殖和侵襲的影響，并探討其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 主要試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，胎牛血清購(gòu)于杭州四季青公司，Lipofectamine2000和Trizol試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。MTT試劑、二甲基亞砜和胰蛋白酶購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。VEGF和MMP-9抗體購(gòu)于武漢博士德公司，β-actin、NF-κB p65 和 p-NF-κB p65 抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)于上?？党缮锕こ逃邢薰?。GDF 15-siRNA(上游5’-CUCAGAGUUGCACUCC GAATT-3’，下游5’-UUCG-GAGUGCAACUCUG AGTT-3’)和陰性對(duì)照(NC)-siRNA(上游 5’-UU CUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，下游 5’-ACGUGA CACGUUCGGAGAATT-3’)購(gòu)于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞裂解液購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)研究所。PVDF膜和Transwell小室購(gòu)于美國(guó)Millpore公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于加拿大Fermentas公司，ECL試劑購(gòu)于美國(guó)Pierce公司。紫外分光光度計(jì)購(gòu)于美國(guó)Pharmacia公司，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀和凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)于Bio-Rad公司，PCR儀購(gòu)于美國(guó)ABI公司，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)于美國(guó)Thermo公司。

1．2 細(xì)胞培養(yǎng) 垂體瘤細(xì)胞株HPAs購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。將解凍復(fù)蘇后的細(xì)胞接種至加有DMEM培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素)的25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合時(shí)，加入2．5 g/L胰蛋白酶消化傳代。

1．3 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染)、GDF15-siRNA組(轉(zhuǎn)染 GDF15-siRNA)和 NC-siRNA組(轉(zhuǎn)染NC-siRNA)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。取生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HPAs細(xì)胞，以每孔2．5×105個(gè)細(xì)胞接種至6孔板上，常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)70%以上時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。以無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基分別稀釋siRNA和Lipofectamine2000后，混和制成siRNA/脂質(zhì)體復(fù)合物。參照 Lipofectamine2000說(shuō)明書(shū)將siRNA/脂質(zhì)體復(fù)合物按照實(shí)驗(yàn)分組轉(zhuǎn)染至垂體瘤細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染6 h后，更換為含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后收集細(xì)胞，采用qRT-PCR和Western blot分別檢測(cè)GDF15 mRNA和蛋白，分析轉(zhuǎn)染效果。

1．4 細(xì)胞增殖率檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HPAs細(xì)胞以每孔104個(gè)接種至96孔板上，培養(yǎng)24 h。參照1．3中的分組方法進(jìn)行處理。每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，并以不含細(xì)胞的培養(yǎng)基作為空白組。分別在培養(yǎng)24、48和72 h后，加入MTT 20μL，4 h后終止培養(yǎng)。棄培養(yǎng)基后，加入二甲基亞砜150μL至MTT結(jié)晶完全溶解。采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)細(xì)胞的光密度(OD)值。細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組OD/空白組OD×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．5 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 收集轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，胰蛋白酶消化，以無(wú)血清培養(yǎng)基制備密度為103個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。向鋪有基質(zhì)膠的Transwell小室的上室中加入細(xì)胞懸液100μL，下室中加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)基。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室。甲醛固定15 min，結(jié)晶紫染色20 min。以棉簽小心擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞，200倍顯微鏡下選取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)穿膜細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．6 qRT-PCR檢測(cè)GDF15 mRNA的表達(dá) 采用Trizol法提取待測(cè)細(xì)胞的總RNA，并以紫外分光光度計(jì)進(jìn)行濃度及純度的定量。取1μg總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA。GDF15上游引物5’-GTTAGCCAAAGACTGCCACTG-3’，下游引物 5’-CCTTGAGCCCATTCCACA-3’，擴(kuò)增片段大小 105 bp;β-actin 上游引物 5’-GGCGGCAACACCATGTAC CCT-3’，下游引物5’-AGGGGCCGGACTCGTCATAC T-3’，擴(kuò)增片段大小202 bp;均由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)、合成。以2μL cDNA為模板，與10 μLMaster Mix、1μL上游引物、1 μL下游引物和6 μL ddH2O配成20μL的PCR反應(yīng)體系。反應(yīng)條件:94℃ 預(yù)變性6 min;95℃變性20 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法計(jì)算GDF15 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．7 W estern blot檢測(cè) GDF15、NF-κB p65、p-NF-κB p65、MMP-9和VEGF蛋白的表達(dá) 向待測(cè)細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液抽提總蛋白，并參照BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)所提取的總蛋白進(jìn)行定量。經(jīng)沸水浴變性后，以每孔總蛋白60μg上樣至SDS-PAGE凝膠孔中行電泳分離。電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上后，采用含50 g/L脫脂奶粉液的TBST封閉液常溫封閉2 h。4℃結(jié)合特異性一抗反應(yīng)24 h，常溫下結(jié)合二抗反應(yīng)2 h。采用ECL發(fā)光顯影后，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，并對(duì)目的蛋白條帶進(jìn)行掃描，以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白與內(nèi)參條帶灰度值比值表示各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22．0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不同組間GDF15 mRNA表達(dá)水平，細(xì)胞增殖率，穿膜細(xì)胞數(shù)，p-NF-κB p65/NF-κB p65 以及MMP-9、VEGF、GDF15蛋白表達(dá)水平的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α =0．05。

2 結(jié)果

2．1 3組細(xì)胞中GDF15蛋白和mRNA表達(dá)水平的比較 結(jié)果見(jiàn)圖1和表1。NC-siRNA組細(xì)胞中GDF15蛋白和mRNA的表達(dá)水平較對(duì)照組無(wú)變化，而GDF15-siRNA組細(xì)胞中GDF15蛋白和mRNA的表達(dá)水平較對(duì)照組降低。

圖1 3組細(xì)胞中GDF15蛋白的表達(dá)

表1 3組細(xì)胞中GDF15蛋白和m RNA相對(duì)表達(dá)量的比較(n=3)

2．2 3組細(xì)胞增殖率的比較 結(jié)果見(jiàn)表2。轉(zhuǎn)染后24、48和72 h，與對(duì)照組相比，NC-siRNA組細(xì)胞的增殖能力無(wú)明顯改變，而GDF15-siRNA組細(xì)胞增殖受抑。

2．3 3組細(xì)胞侵襲能力的比較 結(jié)果見(jiàn)表2。與對(duì)照組相比，NC-siRNA組細(xì)胞侵襲能力無(wú)明顯改變，而GDF15-siRNA組細(xì)胞的侵襲能力受抑。

表2 3組細(xì)胞增殖率和穿膜細(xì)胞數(shù)的比較(n=3)

2．4 3 組 細(xì) 胞 中 p-NF-κB p65/NF-κB p65 和MMP-9、VEGF蛋白表達(dá)的比較 結(jié)果見(jiàn)圖2和表3。與對(duì)照組相比，NC-siRNA組細(xì)胞中NF-κB p65磷酸化水平以及MMP-9、VEGF蛋白的表達(dá)無(wú)明顯改變，而GDF15-siRNA組細(xì)胞中NF-κB p65磷酸化水平和MMP-9、VEGF蛋白的表達(dá)均降低。

圖2 3組細(xì)胞中p-NF-κB p65、NF-κB p65、MMP-9 和 VEGF 蛋白的表達(dá)

表 3 3 組細(xì)胞 p-NF-κB p65/NF-κB p65、MMP-9和VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較(n=3)

3 討論

GDF15基因位于19p12．1-13．1染色體上，編碼的蛋白可通過(guò)多種途徑參與細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等過(guò)程，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有研究［8］發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者血清中GDF15水平升高，且其水平與肝臟受累程度以及患者預(yù)后關(guān)系密切，可作為大腸癌轉(zhuǎn)移的有效生物標(biāo)志物;同時(shí)，GDF15可通過(guò)IGF-1R-FoxM1信號(hào)通路激活上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化來(lái)促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移［9］。另外，在宮頸癌組織中GDF15表達(dá)升高，并且上調(diào)其表達(dá)可通過(guò)激活PI3K/AKT和MAPK/ERK信號(hào)通路上調(diào)CyclinD1、CyclinE1和下調(diào)p21表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖［10］。有學(xué)者［11］發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌組織中GDF15高表達(dá)，而沉默其表達(dá)可顯著抑制BALB/c裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)。此外，在肝癌HepG2細(xì)胞中GDF15高表達(dá)可上調(diào) N-Cadherin、Vimentin、Twist1和下調(diào)E-Cadherin蛋白表達(dá)，促進(jìn)HepG2細(xì)胞的存活、侵襲、遷移和血管生成，而用GDF15-shRNA干擾其表達(dá)后，HepG2細(xì)胞的存活、侵襲、遷移和血管生成均明顯受到抑制［12］。

研究［7］發(fā)現(xiàn)，GDF15在垂體腺瘤組織中表達(dá)較高，且與垂體瘤侵襲性相關(guān)。本研究通過(guò)GDF15-siRNA轉(zhuǎn)染成功下調(diào)GDF15表達(dá)后，垂體瘤HPAs細(xì)胞的增殖和侵襲能力均明顯受到抑制，提示GDF15可能在垂體瘤細(xì)胞增殖和侵襲過(guò)程中發(fā)揮著促進(jìn)作用。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)涉及多種信號(hào)通路活化的復(fù)雜過(guò)程，NF-κB信號(hào)通路就是其中之一。NF-κB是細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB p65是該家族成員中重要的功能性亞單位，磷酸化后可激活NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)控免疫相關(guān)受體、細(xì)胞因子和黏附分子等，參與包括垂體瘤在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展［13］。MMP-9是一種與腫瘤侵襲關(guān)系密切的MMP家族成員，在維持降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程中發(fā)揮重要作用;VEGF是血管形成的重要因子，可通過(guò)激活相應(yīng)受體增加血管通透性和促進(jìn)細(xì)胞增殖;MMP-9和VEGF均是NF-κB信號(hào)通路下游相關(guān)蛋白，在垂體瘤細(xì)胞侵襲和增殖等過(guò)程中發(fā)揮重要作用［14］。有研究［5］指出，過(guò)表達(dá)GDF15可通過(guò)上調(diào)VEGF、MMP-2和MMP-9促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及侵襲;還可通過(guò)上調(diào)NF-κB、MMP-9的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖與侵襲。該研究發(fā)現(xiàn)，GDF15-siRNA能夠明顯抑制HPAs細(xì)胞中NF-κB p65的磷酸化和MMP-9、VEGF的表達(dá)。提示 GDF15可通過(guò)激活 NF-κB信號(hào)通路上調(diào)MMP-9和VEGF的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)垂體瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。

綜上所述，GDF15在垂體瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，GDF15-siRNA可通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路的活化下調(diào)MMP-9和VEGF表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抑制垂體瘤細(xì)胞增殖和侵襲的作用。