莫 靚，韋 兵，賀大璞，聶 軍，梁任技，陽 志，謝首智，吳生榮

南華大學附屬第一醫(yī)院胸外科湖南衡陽421001

食管癌是全球范圍內(nèi)高發(fā)的消化道惡性腫瘤，嚴重危害人類健康和生命［1］。食管癌早期缺乏特異性癥狀且缺少可靠的診斷標志物，大部分食管癌患者確診時已處于中晚期，失去了最佳手術時機，導致其5 a生存率不足10%［2］。食管癌細胞的惡性增殖以及侵襲和轉移是導致患者預后不良的主要原因［3］，因此有效抑制食管癌細胞增殖、侵襲和遷移等惡性生物學行為，尋找潛在的診斷標志和治療靶點，對食管癌的治療具有非常重要的意義。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一種不編碼蛋白質(zhì)、長度＞200 nt的RNA，參與調(diào)控基因的轉錄、翻譯及染色質(zhì)修飾。目前研究［4-5］表明，LncRNA的紊亂表達與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關。Liu等［6］的初步研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA RNU12在食管癌組織中異常高表達。陳施翰等［7］的研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA RNU12通過在轉錄水平上促進熱休克蛋白72的表達，抑制重組人TNF相關凋亡誘導配體TRAIL蛋白的表達，從而誘導肝癌MHCC97-H細胞凋亡。但目前關于RNU12在食管癌中的作用知之甚少。因此，本研究旨在探討RNU12在人食管癌EC9706細胞中的表達水平以及干擾RNU12的表達對EC9706細胞生物學特性的影響，以期為食管癌的診治提供潛在的分子靶點。

1 材料與方法

1．1 材料 人食管鱗癌EC9706細胞株和人正常食管上皮細胞株HEEC購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫，RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司，胰蛋白酶、二甲基亞砜購自美國HyClone公司，Trizol抽提 RNA試劑、反轉錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購自日本TaKaRa公司，Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉染試劑、MTT試劑購自美國Invitrogen公司，RNU12 siRNA序列以及隨機序列(RNU 1 2 siRNA序列:GGG AGAGTTAAAGAGACTAAT;隨機序列:TTCTCC GAACGTGTCACGT)均購自上海吉瑪制藥有限公司，Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒、Transwell小室、Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司。

1．2 EC9706細胞和 HEEC細胞中 LncRNA RNU12表達水平的檢測 采用qRT-PCR法。常規(guī)培養(yǎng)EC9706細胞和HEEC細胞，分別收集處于對數(shù)生長期的兩種細胞，采用Trizol抽提細胞中總RNA，測定濃度和純度后采用反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA。以稀釋后的cDNA為模板，采用 SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進行 PCR擴增。RNU12上游引物 5’-TGCGGCCTTACCCAGTTCTC-3’;下游引物5’-CATGCTGGAGGCTGGGGTTAT ATC-3’，β-actin上游引物5’-GTTTTGTTTTGGC GCTTTTGAC-3’，下游引物 5’-CGCGACCATCCTC CTCTTAG-3’(均由上海生工生物工程有限公司設計合成)，反應條件:95℃預變性3 min;95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。反應結束采用2－ΔΔCt法計算RNU12的相對表達水平。實驗重復3次。

1．3 細胞培養(yǎng)與轉染 取對數(shù)生長期的EC9706細胞接種于6孔板，置37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，待細胞生長密度約為50%時進行轉染，操作步驟參照Lipofectamine2000說明書，轉染RNU12 siRNA的細胞為RNU12 siRNA組，轉染隨機序列的細胞為陰性對照組，未進行轉染處理的EC9706細胞為空白對照組。轉染后各組細胞置37℃常規(guī)培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，轉染4～6 h換液。

1．4 3組細胞中RNU12表達水平的檢測 分別收集轉染48 h的3組細胞，同1．2方法檢測RNU12的表達水平。

1．5 3組細胞增殖能力檢測 將EC9706細胞接種于96孔板，按1．3分組，每組設3個復孔。轉染24、48、72 h后，每孔分別加入5 g/L的MTT溶液20μL，37℃孵育4 h，取出培養(yǎng)板，吸去上清液，每孔加入150μL二甲基亞砜，混勻后，置搖床避光反應10min，待沉淀完全溶解后，使用酶標儀測定490 nm波長處的光密度值，代表細胞的增殖能力。實驗重復3次。

1．6 3組細胞凋亡率檢測 取對數(shù)生長期的EC9706細胞接種到6孔板，按1．3分組，轉染48 h后收集細胞至1．5 mL EP管中，用預冷的PBS洗滌2次，離心收集細胞，用100μL結合緩沖液重懸，依次添加Annexin V-FITC和PI染液各5μL，緩慢混勻后，室溫避光反應15 min，添加結合緩沖液至總體積為500μL，使用流式細胞儀測定凋亡，計算凋亡率。實驗重復3次。

1．7 3組細胞侵襲和遷移能力檢測 分別收集轉染24 h的3組EC9706細胞，用不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞密度為1×105個/孔，取200μL細胞懸液接種到以Matrigel基質(zhì)膠包被的Transwell小室的上室，下室中加入500μL含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，除去舊培養(yǎng)基，以預冷的PBS洗滌小室2次，以40 g/L多聚甲醛固定30 min，吸取固定液晾干，以1 g/L結晶紫染色20min，以預冷的PBS洗滌3次，用棉簽輕輕拭去上室細胞，置顯微鏡下選取5～8個視野觀察并計數(shù)穿膜細胞數(shù)，用以反映細胞侵襲能力。采用同樣的方法檢測細胞遷移能力，區(qū)別在于Transwell小室不以Matrigel基質(zhì)膠包被，其余步驟同侵襲實驗。實驗均重復3次。

1．8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 21．0處理數(shù)據(jù)。應用兩獨立樣本t檢驗比較EC9706細胞和HEEC細胞中RNU12表達水平的差異，應用單因素方差分析比較3組EC9706細胞中RNU12表達水平、光密度值、凋亡率以及侵襲和遷移能力(穿膜細胞數(shù))的差異，兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 EC9706細胞和HEEC細胞中RNU12表達水平的比較 EC9706細胞中RNU12的表達水平(13．28 ±1．42)高于 HEEC 細胞(1．01 ±0．11)(t=14．922，P=0．001)。

2．2 RNU12 siRNA轉染效果觀察 轉染48 h后，空白對照組、陰性對照組和 RNU12 siRNA組EC9706細胞中RNU12的表達水平分別為(1．00±0．10)、(0．98 ± 0．09)和(0．19 ± 0．02)，3 組間相比，差異有統(tǒng)計學意義(F=103．832，P ＜0．001);與空白對照組和陰性對照組比較，RNU12 siRNA組細胞中RNU12表達水平降低(P＜0．05)。

2．3 3組EC9706細胞增殖能力比較 結果見表1。由表1可知，轉染48、72 h，與空白對照組和陰性對照組比較，RNU12 siRNA組細胞增殖能力受到抑制。

表1 3組EC9706細胞增殖能力比較(n=3)

2．4 3組EC9706細胞凋亡率及侵襲、遷移能力的比較 結果見表2。由表2可知，與空白對照組和陰性對照組比較，RNU12 siRNA組細胞凋亡率(轉染48 h)升高，侵襲和遷移能力(轉染24 h)下降。

表2 3組EC9706細胞凋亡率及侵襲、遷移能力的比較(n=3)

3 討論

LncRNA異常表達與人類多種疾病包括腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關［8-10］。多項研究［11-12］已證實，LncRNA有望成為腫瘤早期診斷和預后判定的標志分子以及腫瘤治療的分子靶點。最近，在食管癌中發(fā)現(xiàn)多種異常表達的LncRNA，這些LncRNA在食管癌的發(fā)病和進展中扮演至關重要的角色。Zheng等［13］研究顯示，LncRNA PVT1的高表達能夠促進食管癌上皮-間充質(zhì)轉化和侵襲。Jiao等［14］實驗發(fā)現(xiàn)LncRNA UCA1通過靶向調(diào)控Sox4的表達促進食管癌細胞增殖。LncRNA SNHG7可通過調(diào)節(jié)p15和p16的表達促進食管癌細胞增殖并抑制其凋亡［15］。敲低LncRNA CASC9可抑制食管癌細胞體外遷移和侵襲能力［16］。以上研究表明LncRNA能夠通過影響食管癌細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學特性在食管癌的發(fā)生和發(fā)展中起調(diào)控作用。有研究［17］顯示，RNU12在膀胱癌中異常高表達。另外有研究［7］表明抑制RNU12的表達可誘導肝癌MHCC97-H細胞凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)，RNU12在食管癌EC9706細胞中的表達高于食管上皮HEEC細胞。為探究RNU12的表達改變在食管癌中的作用，本實驗通過脂質(zhì)體轉染法將RNU12 siRNA轉染至食管癌EC9706細胞中，觀察對食管癌細胞生物學特性的影響。結果表明，轉染RNU12 siRNA后，EC9706細胞中 RNU12表達水平降低，說明 RNU12 siRNA能夠干擾EC9706細胞中RNU12的表達。同時，干擾RNU12表達后，EC9706細胞增殖能力受抑，細胞凋亡率上調(diào)，細胞侵襲和遷移能力均受到阻礙。以上實驗結果表明RNU12在食管癌中作為促癌基因發(fā)揮作用，提示RNU12有望成為食管癌治療的潛在靶點。

綜上，RNU12作為促癌LncRNA參與食管癌細胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學行為，可能成為食管癌早期診斷和預后判定的標志分子及治療靶點之一。